Diseñar oligonucleótidos y asegurarse de tener los parámetros correctos para suoligoes un paso importante para asegurar los resultados, especialmente enDiseño de cebador de PCR. Para lograr una amplificación de ADN exitosa, es importante comenzar con el cebador correcto.
¿Qué hace una buena base?
Aquí hay algunas pautas para diseñar sucebadores de PCR:
- Intente que el contenido de GC esté entre el 40 y el 60 % con el 3' de un cebador que termina en G o C para promover la unión. Esto se conoce como abrazadera GC. Las bases G y C tienen enlaces de hidrógeno más fuertes y ayudan con la estabilidad de la imprimación. Tenga cuidado de no tener demasiadas bases G o C repetitivas, ya que esto puede causar la formación de dímeros de cebadores.
- Una buena longitud para los cebadores de PCR es generalmente alrededor de 18-30 bases. La especificidad generalmente depende de la longitud y la temperatura de recocido. Cuanto más cortos sean los cebadores, más eficientemente se unirán o recocerán al objetivo.
- Trate de hacer que la temperatura de fusión (Tm) de las imprimaciones esté entre 65 °C y 75 °C, y dentro de los 5 °C entre sí. Debido a que la Tm depende de la longitud, es importante mantener los cebadores en el extremo más corto. Las bases también afectan la Tm, G y C dan como resultado temperaturas de fusión más altas que A y T. Si la Tm de su iniciador es muy baja, intente encontrar una secuencia con más contenido de GC o extienda un poco la longitud del iniciador.
- Por lo general, se agregan de 3 a 4 nucleótidos a 5 'del sitio de la enzima de restricción en el cebador para permitir un corte eficiente.
- Trate de evitar regiones de estructura secundaria y tenga una distribución equilibrada de dominios ricos en GC y ricos en AT.
- Trate de evitar corridas de 4 o más de una base, o repeticiones de dinucleótidos (por ejemplo, ACCCC o ATATATAT).
- Evite la homología intra-cebador (más de 3 bases que se complementan dentro del cebador) o la homología entre cebadores (cebadores directos e inversos que tienen secuencias complementarias). Estas circunstancias pueden conducir a autodímeros o dímeros de cebadores en lugar de aparearse con las secuencias de ADN deseadas.
- Si está utilizando los cebadores para la clonación, recomendamos la purificación del cartucho como nivel mínimo de purificación.
- Si está utilizando los cebadores para la mutagénesis, intente tener las bases que no coinciden hacia la mitad del cebador.
- Si está utilizando los cebadores para una reacción de PCR que se usará en la clonación Invitrogen TOPO, los cebadores no deben tener una modificación de fosfato.
Solo para uso de investigación. No debe utilizarse en los procedimientos de diagnóstico.
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FAQs
Consejos para el diseño de cebadores de PCR? ›
- Deben tener una temperatura de desnaturalización (o melting) de entre 50 y 70 °C, y no debe diferir entre ambos en más de 5 °C - Deben ser específicos de un solo sitio, evitando regiones con secuencias altamente repetitivas. - No deben formar estructuras secundarias internas (hairpin) o dímeros entre ellos.
¿Qué consideraciones se debe tener a la hora de diseñar los primers? ›Consejos generales para el diseño de primers:
Los primers deben tener una longitud de 17-28b 2. El contenido de G+C debe estar alrededor del 50-60%. 3. Los Tms entre 55-80oC son deseables .
Primer Diseño para PCR
Uno debe bloquear y desbloquear selectivamente repetidamente los grupos reactivos en un nucleótido al agregar un nucleótido uno a la vez . La principal propiedad de los cebadores es que deben corresponder a las secuencias de la molécula molde (deben ser complementarios a la hebra molde).
Una buena longitud para los cebadores de PCR es generalmente alrededor de 18 a 30 bases . La especificidad generalmente depende de la longitud y la temperatura de recocido. Cuanto más cortos sean los cebadores, más eficientemente se unirán o recocerán al objetivo.
¿Qué cebadores se utilizarán para secuenciar su producto de PCR? ›Una PCR estándar utiliza dos cebadores, a menudo llamados cebadores "directo" e "inverso" . Los cebadores directo e inverso están orientados en hebras opuestas del ADN. Durante una ejecución de PCR, los cebadores se unirán al ADN, delimitando la secuencia que desea amplificar.
¿Cómo diseñar cebadores y sondas taqman? ›La longitud óptima del cebador es de 20 bases y la Tm debe mantenerse entre 58 y 60 °C (10 °C menos que la de la sonda, lo que permite el uso de parámetros universales de ciclos térmicos). Tanto para los cebadores como para la sonda, mantenga el contenido de G/C entre el 30 y el 80 % y evite series de cuatro o más nucleótidos G para garantizar una amplificación eficiente .
¿Cómo se elige un cebador para la secuenciación? ›La longitud del cebador debe estar en el rango de 18 a 22 bases. El cebador debe tener un contenido de GC del 50 % al 55 %. Los cebadores deben tener un bloqueo GC en el extremo 3'. La temperatura de fusión de cualquier buen primario debe estar en el rango de 50°C a 55°C.
¿Cómo se conforma un cebador? ›El cebador o primer está formado por nucleótidos de ácido ribonucleico (ARN) (éste es sintetizado por la ARN primasa), que permite que la ADN polimerasa III comience la síntesis de la nueva cadena de ADN. El cebador es la secuencia de inicio en la replicación de la cadena.
¿Cómo se diseñan manualmente cebadores directos e inversos? ›Los cebadores directo e inverso deben tener una separación de aproximadamente 500 pb. El extremo 3' del cebador debe ser una G o una C. La secuencia genómica que proviene de la computadora es solo una hebra; la hebra complementaria no se muestra. Para el cebador directo, puede usar la secuencia directamente .
¿Qué condiciones deben tener los primers utilizados para la PCR? ›Al diseñar primers para PCR se recomienda tener en consideración los siguientes criterios: - Deben ser oligonucleótidos mayores de 18 nucleótidos - Es deseable que tengan un contenido de G/C (40 a 60%) o ligeramente superior, sobre todo hacia el extremo 3', pero evitando largas repeticiones de G (>4).
¿Cuál es la especificidad de los cebadores? ›
La prueba de especificidad de cebadores le permite diseñar cebadores específicos para el objetivo y probar su especificidad frente a secuencias fuera del objetivo en un solo paso . La herramienta de prueba de especificidad utiliza Geneious BLAST para detectar y excluir áreas de gran similitud entre su objetivo y la base de datos fuera del objetivo seleccionado.
¿Por qué los cebadores deben ser específicos? ›La elección de los cebadores apropiados es probablemente el factor más importante que afecta a la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La amplificación específica del objetivo deseado requiere que los cebadores no coincidan con otros objetivos en ciertas orientaciones y dentro de ciertas distancias que permitan una amplificación no deseada.
¿Por qué se necesitan 2 cebadores para la PCR? ›El uso de dos pares de oligonucleótidos permite realizar un mayor número de ciclos, aumentando así la sensibilidad de la PCR . La especificidad mejorada de la reacción se deriva de la unión de dos conjuntos separados de cebadores a la misma plantilla diana.
¿Por qué necesita cebadores directos e inversos en PCR? ›Durante la desnaturalización se liberan dos cadenas sencillas complementarias de ADN. El cebador directo se une al ADN molde, mientras que el cebador inverso se une a la otra hebra complementaria, las cuales se amplifican en la reacción de PCR .
¿Cuántos cebadores se utilizan en la PCR? ›La reacción de PCR utiliza dos cebadores complementarios e hibridantes con hebras opuestas del ADN, uno a la izquierda (5') y otro a la derecha (3') de la secuencia objetivo que se va a amplificar.
¿Cómo saber si los primers son buenos? ›Un requisito general es que las imprimaciones deben tener temperaturas de fusión (Tm) similares y un contenido de G/C equilibrado , pero deben evitar la autocomplementación y la estructura de horquilla.
¿Qué es el diseño de primers? ›El diseño de primers es una parte sustancial dentro de los ensayos de PCR, el mismo es aplicado en la caracterización de microorganismos, secuenciación, cuantificación, etc.
¿Por qué diseñamos primers? ›Los pares de cebadores diseñados idealmente garantizarán la eficiencia y la especificidad de la reacción de amplificación , lo que dará como resultado un alto rendimiento del amplicón deseado.