La reacción en cadena de la polimerasa: una descripción general y el desarrollo de protocolos de PCR de diagnóstico en el LCDC (2023)

TEl desarrollo a fines de la década de 1980 de un propietarioEl método para la amplificación in vitro de secuencias específicas de ADN o ARN mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ha revolucionado la biología molecular. La PCR tiene muchas aplicaciones en biología y ofrece un tremendo potencial de diagnóstico temprano en muchas áreas de la medicina y las enfermedades infecciosas. La clave del éxito de la PCR en el diagnóstico reside en su capacidad para amplificar regiones dentro de una sola molécula de ADN que pueden tener un significado etiológico.

La PCR puede producir fácilmente más de un millón de copias de una secuencia específica de ADN o ARN en un simple proceso de ciclo de tres pasos. El paso inicial implica la desnaturalización del ADN de doble cadena para separar las cadenas complementarias, y el segundo paso permite la hibridación de los cebadores con las cadenas de ADN disociadas. En tercer lugar, los cebadores participan en una reacción de extensión catalizada por una ADN polimerasa termoestable y luego se repite el ciclo. La reacción de PCR utiliza dos cebadores complementarios e hibridantes con hebras opuestas del ADN, uno a la izquierda (5') y otro a la derecha (3') de la secuencia objetivo que se va a amplificar. Si la plantilla es una secuencia de ARN, primero se debe sintetizar una copia de ADN (ADNc) utilizando una transcriptasa inversa antes de iniciar la PCR. Las copias de ADN o "amplicones" generalmente se producen en unas pocas horas después de aproximadamente 30 ciclos de 3 a 5 minutos en los que la extensión enzimática teóricamente duplica la cantidad de ADN del ciclo anterior. Aunque se han utilizado diferentes ADN polimerasas en aplicaciones de PCR, la más conveniente es la polimerasa termoestable ‘Taq'aislado deTermitas aqualicus.Taqla polimerasa es capaz de soportar las altas temperaturas requeridas para desnaturalizar el ADN y ha permitido la automatización opcional de la técnica usando termocicladores programables ahora disponibles de una variedad de fuentes comerciales.

El método más común para visualizar los amplicones generados en el procedimiento de PCR es la electroforesis en gel en poliacrilamida o agarosa, seguida de la tinción con bromuro de etidio. Los tamaños observados del fragmento amplificado deben ser idénticos a los previstos a partir de la secuencia de nucleótidos conocida. La hibridación no específica de los cebadores con secuencias distintas de las diana suele generar fragmentos de amplificación de tamaños diferentes del amplicón deseado. Debido a que dicha amplificación no dirigida no es infrecuente, deben evitarse como medios de detección métodos como la espectroscopia ultravioleta y la fluorometría, que solo indican un aumento en la cantidad total de ADN presente. Para asegurarse de que la secuencia diana se ha amplificado, se recomienda probar la especificidad probando una transferencia Southern del gel analítico, o transferencias puntuales, con sondas marcadas anidadas entre los cebadores de PCR y que representan una porción de la secuencia amplificada. secuencia, o que se deben usar digestiones con endonucleasas de restricción específicas para sitios dentro del amplicón. Para todas las aplicaciones de PCR, las técnicas de preparación de muestras y los métodos de amplificación y detección deben optimizarse durante la fase de investigación y desarrollo.

Se reconoce que las ADN polimerasas no duplican el ADN con total fidelidad y que se produce una incorporación errónea de nucleótidos. En la naturaleza, la mayoría de estas polimerasas poseen una actividad correctora que eliminará los nucleótidos mal incorporados y los reemplazará con la base correcta. Las polimerasas preparadas comercialmente a menudo carecen de esta función de revisión, como es el caso deEtiquetapolimerasa, y se ha estimado una tasa de error de sustitución de base de una en 10.000 bases polimerizadas paraTaq(1). La posibilidad de una incorporación errónea de nucleótidos ha requerido modificaciones en las técnicas establecidas cuando los datos de secuenciación deben obtenerse después de la amplificación por PCR. La máxima fidelidad se puede lograr mediante una combinación de concentraciones óptimas de trifosfato de desoxinucleósido in vitro, pH, cationes metálicos divalentes, fuerza iónica y condiciones de temperatura. Las desviaciones de estos valores óptimos establecidos pueden generar productos de amplificación anómalos.

Las amplificaciones positivas falsas son un problema potencial con todas las aplicaciones de PCR de diagnóstico, y la fuente más grave surge del arrastre de ADN de una amplificación previa de la misma secuencia objetivo en lugar de la contaminación de muestra a muestra durante el procesamiento contemporáneo. Como resultado, se deben tomar precauciones en el laboratorio de PCR para evitar este arrastre. Las medidas de seguridad esenciales incluyen la separación física de las amplificaciones previas y posteriores a la PCR, los reactivos en alícuotas, las pipetas de desplazamiento positivo y la selección juiciosa de los controles, además de una técnica meticulosa cuando se utiliza una variedad de equipos y suministros de laboratorio.

Afortunadamente, una amplia variedad de muestras clínicas es adecuada para el análisis genotípico en aplicaciones de PCR. Estas muestras incluyen sangre entera o glóbulos blancos, otros fluidos corporales como orina o heces, hisopos clínicos, frotis secos y tejidos incluidos en parafina. Los tejidos fijados en metanol o etanol al 50% son superiores a los fijados en formalina en que el rendimiento de ADN es mayor y se produce una menor degradación de los ácidos nucleicos. Se ha utilizado sangre heparinizada o citratada para el análisis de ADN, además de frotis de sangre secados al aire en portaobjetos opcionalmente fijados con etanol o metanol.

Las aplicaciones de investigación de la tecnología PCR son numerosas. Una lista parcial incluiría la clonación genómica directa de ADN o ADNc, la huella genética de muestras forenses, el análisis de variaciones de secuencias alélicas y la secuenciación directa de nucleótidos. La PCR tiene el potencial de reemplazar muchas técnicas de diagnóstico convencionales para enfermedades infecciosas y genéticas en la medicina clínica. Actualmente, la PCR se está utilizando para estudiar enfermedades genéticas como la hemofilia, la fibrosis quística, el retinoblastoma, la enfermedad de Huntington, la anemia de células falciformes y la beta-talasemia, la enfermedad de von Willebrand, la neuropatía óptica de Leber, la distrofia muscular, la fenilcetonuria, Tay-Sachs y alfa- 1 -deficiencia de antitripsina. La PCR también se puede usar para detectar mutaciones puntuales en el gen de la insulina, detectar una sola célula de linfoma en presencia de 10⁶células normales, estudiar translocaciones cromosómicas, detectar deleciones del gen de la hormona del crecimiento y determinar el polimorfismo del gen del antígeno de linfocitos humanos (HLA) clase II.

La PCR tiene una ventaja sobre la tecnología competidora de hibridación de ADN en que la sensibilidad es suficiente para permitir la detección directa de ADN microbiano en un alto porcentaje de muestras patológicas positivas conocidas, una cualidad que no siempre se encuentra en los métodos de hibridación de ADN. Esta técnica genotípica, sin embargo, también detecta cepas portadoras de genes, independientemente de la expresión génica. Por lo tanto, un resultado positivo en la PCR solo es indicativo de la presencia de la secuencia del gen objetivo y no refleja la viabilidad o las actividades tóxicas patógenas del organismo en la muestra. La PCR puede complementar los protocolos de amplificación del crecimiento que a menudo pueden fallar en la detección de cepas virulentas presentes en niveles bajos en muestras patológicas o de alimentos. Con frecuencia, las cepas no patógenas del mismo género o especie superan a los patógenos, y las cepas pueden perder fácilmente los factores de virulencia mediados por plásmidos o fagos. La PCR permite la replicación enzimática específica de fragmentos de genes específicos y, dado que no se requiere el crecimiento ni la replicación celular, se detectarán e identificarán con igual facilidad tanto las células lesionadas como las viables. En los alimentos, un indicador de células muertas brinda información valiosa sobre la calidad del alimento, pero puede no ser indicativo de un peligro para la salud. La PCR se puede realizar utilizando células bacterianas completas sin extracción de ácidos nucleicos y, junto con el crecimiento previo al enriquecimiento antes de la PCR, diluye el ADN que no se duplica biológicamente, lo que permite la identificación de organismos en muestras que contienen cantidades de bacterias patógenas indetectables por otros. métodos de rutina. La identificación de genes diana relacionados con la virulencia mediante la PCR ofrece una alternativa muy específica, sensible, relativamente rápida y económica a los ensayos in vitro tradicionales, que dependen de una expresión génica adecuada para su fiabilidad y sensibilidad. Se remite al lector interesado a información de procedimiento más detallada en los manuales de laboratorio (1–3) y artículos de revisión recientes sobre PCR (4–18).

Las aplicaciones de PCR para el diagnóstico de enfermedades infecciosas ocurrieron primero con infecciones virales, para las cuales la detección temprana es particularmente importante. Los resultados de la PCR se pueden obtener en el plazo de un día desde la recepción de las muestras en el laboratorio. Actualmente existen protocolos de PCR específicos y sensibles publicados para la detección y tipificación de virus del papiloma genital humano, virus de la inmunodeficiencia humana tipos 1 y 2, virus linfotrópico de células T humanas tipo I, virus de la hepatitis A, B y C, varios serotipos de enterovirus humanos, virus del herpes y rotavirus, parvovirus humano B19, rinovirus, virus de la pseudorrabia, virus de la rubéola, paramixovirus que causan paperas y sarampión, citomegalovirus y virus de Epstein-Barr. La PCR también se ha utilizado para establecer la etiología viral tanto en la meningitis enteroviral como en la miocarditis viral.

Los procedimientos de PCR se han combinado con sondas dirigidasEscherichia coliy genes de legionella y se han aplicado a la detección de patógenos bacterianos en muestras de agua ambiental. Esta combinación de técnicas proporciona la sensibilidad y la especificidad necesarias para monitorear bacterias patógenas en aguas ambientales. Hasta la fecha también se han publicado protocolos de PCR para infección aguda por tifus, detección de shigella en heces, toxigénicoE. coli, bacterias coliformes totales,Legionella pneumophila, Mycobacteriumespecies,Bordetella pertussis, Mycoplasma pneumonia, Borrelia burgdorferi, Treponema pallidum, Coxiella burnettii, Candida albicans, Rickettsia rickettsii, Trypanosoma congolenseyTrypanosoma bruceisubespecie. Todas estas enfermedades infecciosas se pueden diagnosticar con mayor sensibilidad y especificidad en un marco de tiempo más corto o igual ya un costo sustancialmente menor mediante PCR que mediante técnicas convencionales.

La aplicación de la tecnología PCR para la detección y el diagnóstico de patógenos bacterianos ha sido una prioridad reciente en el Centro de Laboratorio para el Control de Enfermedades (LCDC). El Dr. D. Russell Pollard del Laboratorio Nacional de Patógenos Especiales de la Oficina de Microbiología fue uno de los primeros investigadores en Canadá en desarrollar protocolos de PCR para detectar microbios patógenos asociados con enfermedades humanas. Desde su prematura e inoportuna muerte en junio de 1990, sus compañeros han continuado la revolucionaria labor iniciada en su laboratorio. La investigación y el desarrollo actuales en el LCDC siguen la iniciativa establecida por el Dr. Pollard y se centran en protocolos de diagnóstico de PCR dirigidos a factores de virulencia y patogenicidad asociados con una variedad de agentes infecciosos importantes en enfermedades humanas.

Hasta la fecha, hemos desarrollado varios protocolos de PCR. El primero fue para la detección específica declamidiaespecies tanto en muestras de laboratorio de células McCoy infectadas como en especímenes clínicos. En un proyecto de colaboración entre el LCDC y el laboratorio provincial de Cadham en Manitoba, las pruebas paralelas de este PCR y Abbott Chlamydiazyme^™Los procedimientos se completaron recientemente en 274 muestras clínicas con resultados muy prometedores.

En otro trabajo, una batería de cebadores específicos de verotoxina dio como resultado protocolos de PCR para detectar y distinguir específicamente los genes de VT1, VT2 y VTe en aislados humanos y no humanos de verotoxigénicos.E. coli.Uno de los protocolos de PCR desarrollados en el LCDC en el estudio de la verotoxina distinguió claramente los genes muy relacionados que codifican VT2 y VTe. Además, una contribución muy significativa se centró en la diferenciación de genes prácticamente idénticos para la shigatoxina deDisentería por Shigella1 yE. coliVT1. Los protocolos de PCR de verotoxina se están aplicando actualmente al análisis genotípico completo de verotoxigénicos.E. coliaislado de carnes al por menor y verotoxigénicoE. coliasociado con el síndrome urémico hemolítico pediátrico.

El LCDC acaba de publicar un estudio sobre la detección del gen de la aerolisina en aislados clínicos deAeromonas hydrophilapor la PCR, y estos cebadores deberían tener aplicación como sonda de virulencia específica de especie para distinguir cepas beta-hemolíticas deUna hidrófilayAeromonas sobrio.Otra importante investigación, también recientemente finalizada en el LCDC, describe la detección de genes por PCR para enterotoxinas A a E, toxinas exfoliativas A y B, y síndrome de shock tóxico toxina-1 enStaphylococcus aureus.

REFERENCIAS