PCR Multiplex: Optimización y Aplicación en Virología Diagnóstica (2023)

TABLA 1

Lista representativa de aplicaciones de PCR multiplex para el diagnóstico de enfermedades infecciosas

Cebadores y Eficiencia de PCR Multiplex

Las primeras rondas de ciclos térmicos tienen un efecto sustancial en la sensibilidad y especificidad general de la PCR (92). Suponiendo una desnaturalización eficiente del objetivo, el éxito general de la amplificación específica depende de la velocidad a la que los cebadores se hibridan con su objetivo y la velocidad a la que los cebadores hibridados se extienden a lo largo de la secuencia deseada durante los ciclos temprano, medio y tardío de la amplificación. Los factores que impiden las tasas de recocido óptimas incluyen cebadores mal diseñados y componentes de tampón y temperatura de recocido subóptimos. La tasa de extensión de los híbridos cebador-objetivo específicos depende de la actividad de la enzima, la disponibilidad de componentes esenciales como los desoxirribonucleósidos trifosfatos (dNTP) y la naturaleza del ADN diana. Por lo tanto, la mayoría de las modificaciones para mejorar el rendimiento de la PCR se han dirigido a los factores que afectan las tasas de hibridación y/o extensión.

La optimización de las PCR multiplex puede presentar varias dificultades, incluida una baja sensibilidad o especificidad y/o una amplificación preferencial de ciertos objetivos específicos (76). La presencia de más de un par de cebadores en la PCR multiplex aumenta la posibilidad de obtener productos de amplificación espurios, principalmente debido a la formación de dímeros de cebadores.9). Estos productos no específicos pueden amplificarse de manera más eficiente que el objetivo deseado, consumiendo los componentes de la reacción y produciendo tasas de hibridación y extensión deterioradas. Por lo tanto, la optimización de la PCR múltiplex debe tener como objetivo minimizar o reducir dichas interacciones no específicas. Es posible que se deban utilizar pruebas empíricas y un enfoque de prueba y error cuando se prueban varios pares de cebadores, porque no hay forma de predecir las características de rendimiento de un par de cebadores seleccionado, incluso entre aquellos que satisfacen los parámetros generales del diseño de cebadores (43). Sin embargo, se debe prestar especial atención a los parámetros de diseño de cebadores, como la homología de los cebadores con sus secuencias de ácido nucleico diana, su longitud, el contenido de GC y su concentración.26,sesenta y cinco,72,88,95,120). Idealmente, todos los pares de cebadores en una PCR multiplex deberían permitir eficiencias de amplificación similares para su objetivo respectivo. Esto se puede lograr mediante la utilización de cebadores con temperaturas de hibridación óptimas casi idénticas (una longitud de cebador de 18 a 30 pb o más y un contenido de GC de 35 a 60 % pueden resultar satisfactorios) y no deben mostrar una homología significativa ni internamente ni entre sí. (17,26,43).

La amplificación preferencial de una secuencia diana sobre otra (sesgo en la relación plantilla-producto) es un fenómeno conocido en las PCR multiplex que están diseñadas para amplificar más de una diana simultáneamente (68,76,109). Sobre la base de modelos teóricos y estudios experimentales, se han identificado dos clases principales de procesos que inducen este sesgo, deriva de PCR y selección de PCR (108). La desviación de la PCR es un sesgo que se supone que se debe a la fluctuación estocástica en las interacciones de los reactivos de la PCR, particularmente en los primeros ciclos, que podría surgir en presencia de concentraciones de plantilla muy bajas (26,68); variaciones en los perfiles térmicos de un termociclador, lo que resulta en temperaturas de rampa desiguales; o simple error experimental. La selección por PCR, por otro lado, se define como un mecanismo que inherentemente favorece la amplificación de ciertas plantillas debido a las propiedades del objetivo, las secuencias flanqueantes del objetivo o el genoma completo del objetivo. Estas propiedades incluyen diferencias interregionales en el contenido de GC, lo que lleva a una desnaturalización preferencial; mayor eficiencia de unión debido a los cebadores ricos en GC; accesibilidad diferencial de objetivos dentro de los genomas debido a estructuras secundarias; y el número de copias del gen dentro de un genoma. Además, se ha demostrado que la elección de los cebadores es crucial para evitar la selección por PCR. Se han descrito sesgos de amplificación que dependían en gran medida de la elección de los cebadores y en menor medida de las plantillas (100). Algunos pares de cebadores con alta eficiencia de amplificación dieron como resultado la saturación de los moldes (fase de meseta), mientras que otros pares de cebadores produjeron un producto independiente de las concentraciones iniciales del molde. Los cebadores con menor eficiencia de amplificación dieron como resultado concentraciones de producto por debajo de las concentraciones de saturación y, según la plantilla, se observó la relación de producto esperada o el sesgo.

Otros componentes de PCR

La alteración de otros componentes de la PCR, como los constituyentes del tampón de la PCR, los dNTP y las concentraciones de enzimas en la PCR múltiplex con respecto a los informados para la mayoría de las PCR uniplex, por lo general genera poca o ninguna mejora en la sensibilidad o la especificidad de la prueba. El aumento de la concentración de estos factores puede aumentar la probabilidad de un cebado incorrecto con la producción posterior de productos de amplificación inespecíficos falsos. Sin embargo, la optimización de estos componentes en las PCR multiplex que están diseñadas para la amplificación simultánea de múltiples objetivos puede resultar beneficiosa. Por ejemplo, en la PCR multiplex para el gen de la distrofina (nueve objetivos genómicos), unTaqConcentración de ADN polimerasa (con un aumento apropiado de MgCl₂concentración) de cuatro a cinco veces mayor que la requerida en uniplex PCR fue necesaria para lograr una amplificación óptima de ácido nucleico (19). La variación en las concentraciones de los componentes de la reacción por encima de las utilizadas en la PCR uniplex probablemente refleja la naturaleza competitiva del proceso de PCR. El ADN objetivo deseado puede verse superado por la amplificación más eficiente de otros objetivos (incluidos los productos no específicos), lo que conduce a una disminución en la eficiencia de la amplificación de los objetivos deseados y, por lo tanto, en la sensibilidad de la reacción.79).

Se ha informado que los aditivos de PCR, como el dimetilsulfóxido, el glicerol, la albúmina de suero bovino o la betaína, son beneficiosos en las PCR multiplex.49,62). Los componentes pueden actuar para evitar el estancamiento de la polimerización del ADN, lo que puede ocurrir a través de la formación de estructuras secundarias dentro de las regiones del molde de ADN durante el proceso de extensión (44). Dichos codisolventes también pueden actuar como agentes desestabilizadores, reduciendo la temperatura de fusión de las secuencias ricas en GC, o como osmoprotectores, aumentando la resistencia de la polimerasa a la desnaturalización.44,83).

Variaciones en la metodología para mejorar la sensibilidad y la especificidad

Una solución directa a las dificultades encontradas en el desarrollo de PCR multiplex ha sido el uso de PCR de arranque en caliente (21) y/o PCR anidado (123). El primero a menudo elimina las reacciones no específicas (particularmente la producción de dímeros de cebadores) causadas por el recocido de cebadores a baja temperatura (4 a 25°C) antes del comienzo del termociclado (21). Recientemente, el procedimiento se ha hecho más práctico mediante el uso de una metodología de arranque en caliente no mecánica que implica el uso de una forma deTaqpolimerasa, por ejemplo, Amplitaq Gold (Roche Diagnostics), que se activa solo si la mezcla de reacción se calienta a aproximadamente 94 °C durante 10 min (el primer paso de desnaturalización) (8,53). La PCR anidada aumenta la sensibilidad y la especificidad de la prueba a través de dos rondas independientes de amplificación utilizando dos conjuntos de cebadores discretos. Aunque esta adaptación es sin duda efectiva en la mayoría de los casos, también complica considerablemente la aplicación práctica de la PCR. La segunda ronda de amplificación retrasa los resultados, aumenta la posibilidad de contaminación cruzada y puede complicar la automatización.

Consideraciones generales para el desarrollo de PCR multiplex

El desarrollo de PCR multiplex debe seguir un enfoque racional para la inclusión o exclusión de patógenos específicos en el ensayo. Estos patógenos pueden ser específicos del sistema de órganos o específicos de los síntomas con respecto a la edad del paciente y las características epidemiológicas de estos patógenos. Las condiciones de la PCR, como la compatibilidad entre los cebadores dentro de la mezcla de reacción de modo que no haya interferencia, son de gran importancia técnica. Los pares de cebadores deben ser inclusivos para tantas cepas del patógeno objetivo como sea posible y, según el método de detección de amplicón, sus objetivos se pueden resolver fácilmente. Esto último se puede lograr mediante el uso de pares de cebadores que dan como resultado productos de PCR que se pueden separar y visualizar claramente mediante electroforesis en gel o sondas de hibridación con la máxima especificidad. Antes de la aplicación en un entorno clínico, se debe evaluar la sensibilidad de las PCR multiplex en comparación con las PCR uniplex correspondientes utilizando diluciones en serie del ADN objetivo y muestras clínicas.

Siempre que sea posible, las PCR multiplex deben evitar el uso de cebadores anidados que requieren una segunda ronda de amplificación. Este último es uno de los principales contribuyentes a los resultados falsos positivos debido a la contaminación por arrastre, aunque se deben implementar protocolos anticontaminación que incluyan controles de PCR (controles de reacción y extracción de muestras) en todos los protocolos basados ​​en PCR (55). Asimismo, se deben considerar precauciones y metodologías para evitar resultados falsos negativos debido a fallas en la reacción (104). Se han desarrollado PCR multiplex que amplifican las secuencias diana junto con la presencia de ácidos nucleicos diana de control externo o interno para indicar el fracaso de la reacción (49,62,69).

TABLA 2

Aplicación de la PCR multiplex para el diagnóstico de infecciones víricas

Virus neurotrópicos

La PCR ha demostrado ser una herramienta poderosa para investigar la meningitis y la encefalitis causadas por una variedad de virus. En las enfermedades neurológicas, el requisito de un diagnóstico rápido y confiable para proporcionar una base racional para la quimioterapia y limitar los procedimientos innecesarios y la terapia irrelevante ha impulsado el desarrollo. La amplia gama de virus asociados con enfermedades neurológicas incluye el virus del herpes simple (HSV); citomegalovirus (CMV); virus de la varicela-zoster (VZV); virus de Epstein-Barr (VEB); virus del herpes humano 6 (HHV-6); el grupo de los enterovirus, incluidos los echovirus, los poliovirus y los coxsackievirus; adenovirus; virus JC y BK; arenavirus; paramixovirus; rabia; y arbovirus. En vista de la gran cantidad de virus potencialmente neuroinvasivos y debido al volumen limitado de la muestra diagnóstica más útil, el líquido cefalorraquídeo (LCR), se han desarrollado varias PCR multiplex.12–15,82,102).

Se ha descrito la viabilidad de la detección simultánea de virus, bacterias y parásitos en muestras de LCR de pacientes con meningitis aséptica o encefalitis.82). Este estudio de Read et al. (82) utilizaron tres PCR multiplex anidadas para la detección de HSV y VZV; VEB y HHV-6; y miembros del grupo enterovirus y echovirus tipo 22 y 23. Además, se utilizaron dos PCR uniplex para la detección de virus CMV y JC. En un total de 2233 muestras de LCR de 2162 pacientes, la PCR fue positiva en 147 muestras de 143 pacientes (6,6 % de todos los pacientes), incluidos enterovirus (77 pacientes), HSV-1 (20 pacientes), VZV (7 pacientes), HSV tipo 2 (HSV-2) (6 pacientes), CMV (3 pacientes), virus JC (2 pacientes) y HHV-6 (1 paciente). Todos los ensayos de PCR resultaron negativos con 28 muestras de LCR de control. No se determinaron la sensibilidad y la especificidad clínicas de esta PCR porque no se disponía de información clínica completa para todos los pacientes.

También se ha descrito una PCR multiplex anidada para la detección y diferenciación de HSV-1 y -2 sobre la base del tamaño del producto PCR (14). En un análisis prospectivo, se analizaron mediante PCR multiplex un total de 417 muestras de LCR obtenidas de 395 pacientes consecutivos con sospecha clínica de encefalitis, meningitis o meningoencefalitis por HSV. La prueba fue positiva para HSV-1 en 11 muestras (2,6 %) de 10 pacientes y para HSV-2 en 4 muestras (1,0 %) de 3 pacientes; no se informó coinfección con ambos tipos. Se utilizó la misma PCR multiplex para analizar un total de 178 muestras de LCR obtenidas de 171 pacientes con sospecha clínica de infección por el virus del herpes (15). El ensayo dio positivo para HSV-1 en tres muestras (1,7 %) de dos pacientes (1,2 %) y para HSV-2 en una muestra, y un paciente dio positivo en una PCR CMV uniplex anidada. Se aplicó un procedimiento similar para detectar el ADN de ambos virus (HSV-1 y -2) a muestras de LCR de 918 pacientes infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) con síntomas neurológicos (22). En los pacientes en los que se confirmó el diagnóstico en la autopsia, la prueba fue positiva para HSV-1 o -2 en 19 pacientes (2 %), produciendo una sensibilidad y especificidad del 100 y el 99,6 %, respectivamente.

La primera PCR multiplex anidada para la detección y tipificación de herpesvirus (HSV-1 y -2, VZV, CMV, HHV-6 y EBV) se aplicó al LCR de pacientes con meningitis, encefalitis y otros síndromes clínicos.102). Al utilizar concentraciones equimolares de cebadores que alinean los extremos 3' con una de las dos regiones de consenso dentro del gen de la polimerasa de ADN del herpesvirus y los extremos 5' con las secuencias relacionadas o no relacionadas de cada agente que se va a amplificar, la primera ronda de amplificación arrojó un 194- fragmento de pb que indica la presencia de herpesvirus. La segunda ronda de amplificación utilizando mezclas de cebadores contenía cebadores no homólogos y específicos de tipo seleccionados de diferentes regiones de los genes alineados de la ADN polimerasa de los herpesvirus humanos para producir un producto con un tamaño diferente para cada virus relacionado. El método amplificó el virus correspondiente en células infectadas y en cinco muestras clínicas (LCR positivo para VHS-1 PCR de un paciente con encefalitis, LCR positivo para VHS-2 PCR de un paciente con meningitis, líquido vesicular positivo para cultivo de VZV de un paciente con herpes zóster, orina con cultivo positivo para CMV de un paciente con infección congénita y sangre periférica con PCR positivo para EBV de un paciente con síndrome linfoproliferativo). Además, el uso de cebadores dirigidos a regiones de consenso puede permitir el reconocimiento de nuevos herpesvirus humanos no descritos. La detección de un fragmento de 194 pb después de la primera reacción sin señal positiva en la segunda ronda de amplificación podría reflejar la detección de un nuevo herpesvirus humano. La prueba se modificó aún más para incluir un paso de transcripción inversa y pares de cebadores para detectar ADNc de enterovirus (12). Esta PCR se evaluó luego en 21 pacientes con meningitis aséptica y encefalitis etiológicamente bien caracterizadas. Se detectó ADN de HSV en nueve pacientes, ADN de VZV en 6 pacientes y ARN de enterovirus en 6 pacientes. La prueba se evaluó más a fondo para la detección de estos mismos virus en muestras de LCR mediante un estudio prospectivo de 200 pacientes con enfermedades neurológicas que se sospechaba tenían infecciones virales. Se detectó enterovirus en 49 pacientes, HSV se detectó en 3 pacientes, VZV se detectó en 6 pacientes, CMV se detectó en 12 pacientes, EBV se detectó en 2 pacientes, CMV y HSV se detectaron en un paciente con SIDA y encefalitis, y CMV y Se detectó EBV en otro paciente de SIDA con polirradiculomielitis. Para la detección de echovirus 30 en 50 pacientes con meningitis aséptica, la transcripción inversa (RT)-PCR múltiplex fue más sensible (90 % de sensibilidad) que el cultivo celular (26 % de sensibilidad) y la prueba Amplicor EV (86 % de sensibilidad). Estos estudios demuestran la utilidad de esta RT-PCR multiplex para la detección de enterovirus y herpesvirus en muestras de LCR de pacientes con diversas manifestaciones neurológicas y la utilidad de la técnica en el manejo de pacientes y el diseño de terapia antiviral.

En el Reino Unido, se desarrolló y evaluó una PCR multiplex anidada para la detección de HSV-1 y -2, VZV y enterovirus, las cuatro causas más comunes de meningitis y encefalitis virales, utilizando un total de 1683 muestras consecutivas de LCR (81). La prueba fue positiva en 138 (8,2%) de las muestras (enterovirus en 51 muestras, HSV-2 en 33 muestras, VZV en 28 muestras y HSV-1 en 25 muestras). De los 51 pacientes positivos para ARN de enterovirus, 17 eran bebés menores de 6 meses en quienes se detectó la infección del SNC como parte de un examen general de infección y 34 pacientes eran niños mayores y adultos que tenían encefalitis y meningitis. En el grupo positivo para VZV (28 pacientes), 16 pacientes tenían meningitis y 10 tenían encefalitis pero los detalles clínicos no estaban disponibles para 2 pacientes. El VHS-1 se detectó en dos bebés menores de 6 meses y en 23 adultos (22 con encefalitis y 1 con meningitis linfocítica benigna). Los pacientes con HSV-2 positivo (33 pacientes) incluyeron cinco bebés menores de 6 meses, dos adultos con meningoencefalitis y 26 pacientes mayores de 6 meses con meningitis linfocítica benigna. Estas pruebas demostraron ser adecuadas para el uso rutinario en un laboratorio de diagnóstico y destacaron la importancia de la detección de más de un virus en pacientes con meningitis y encefalitis.

Aunque los estudios descritos anteriormente (13–15,81,82,102) produjeron resultados satisfactorios en términos de detección simultánea de virus asociados con manifestaciones neurológicas (por ejemplo, herpesvirus), las PCR multiplex desarrolladas utilizaron una estrategia anidada. Este último, como se describió anteriormente, puede aumentar la posibilidad de resultados falsos positivos debido a la contaminación y también puede complicar la automatización. Un estudio reciente (63) utilizó un ensayo de PCR que excluye el uso de cebadores anidados para la amplificación simultánea de ADN de herpesvirus. Este ensayo, denominado PCR de consenso, utiliza un par de cebadores de "escalera", que se basan en secuencias de consenso seleccionadas dentro del gen de la ADN polimerasa y eran 76 a 86% idénticas a las secuencias genómicas de los seis herpesvirus (HSV-1, HSV -2, CMV, EBV, VZV y HHV-6) que pueden infectar el SNC. Cada cebador de escalera utilizado comprendía una mezcla equimolar de 11 oligonucleótidos correspondientes a una secuencia consenso: todos los cebadores tenían el mismo extremo 5' pero se extendían de 20 a 30 nucleótidos en la dirección 3'. Los productos de la PCR se analizaron mediante hibridación en placas de microtitulación utilizando sondas de oligonucleótidos biotinilados específicos de virus. La PCR de consenso se evaluó utilizando 142 muestras de LCR previamente analizadas mediante PCR uniplex estándar. Dieciocho muestras (12,7 %) dieron positivo en PCR uniplex y 37 (26 %) dieron positivo en PCR consenso, incluidas 3 muestras que tenían coinfecciones (CMV, VZV y HSV-2; VZV y HSV-2; y CMV y HHV-6). De las 142 muestras de LCR, 103 se clasificaron como negativas tanto por PCR uniplex como por PCR consenso. Además, la prueba mostró una gran utilidad diagnóstica en el sentido de que varios casos resultaron positivos para virus para los cuales el médico no solicitó pruebas.

El problema al evaluar todos los estudios de PCR multiplex mencionados anteriormente es que la mayoría no ha incluido detalles completos del paciente. Por lo tanto, si bien muchos resultados positivos se han relacionado con enfermedades clínicas compatibles, no se informan resultados positivos en todos los pacientes con condiciones similares. No obstante, la PCR multiplex detecta más muestras positivas y es más rápida que las técnicas convencionales como el cultivo o la serología. Sin embargo, estos últimos procedimientos son insensibles o lentos y constituyen un criterio insatisfactorio ("estándar de oro") para medir la precisión de la PCR multiplex. Debido a que la PCR uniplex tiene más datos disponibles y, por lo tanto, está mejor fundamentada en cuanto a su valor clínico, los resultados de la PCR multiplex deben compararse con los de la PCR uniplex para garantizar que la PCR multiplex tenga sensibilidad, especificidad y relevancia clínica equivalentes.

Virus Respiratorios

Los virus que comúnmente causan infecciones respiratorias incluyen el virus respiratorio sincitial (RSV), los virus de la influenza y los virus parainfluenza (PIV) y los adenovirus, especialmente en bebés y niños pequeños. La infección con estos virus puede provocar una enfermedad grave de las vías respiratorias superiores o inferiores que requiera hospitalización. Por lo tanto, las pruebas sensibles y rápidas para estos virus son cruciales para reducir el potencial de transmisión nosocomial a pacientes de alto riesgo, limitar el uso innecesario de antibióticos y dirigir la terapia adecuada después de un diagnóstico específico.119). Por esta razón, varios estudios han tenido como objetivo desarrollar y evaluar la PCR multiplex para la detección de estos virus y proporcionaron evidencia sustancial de la utilidad de esta técnica como una herramienta importante para el manejo de pacientes que presentan infecciones respiratorias. Varios estudios han utilizado PCR multiplex para detectar y tipificar o subtipificar virus de influenza, PIV y RSV en muestras clínicas y se resumen a continuación.

Se utilizó una RT-PCR multiplex anidada que incluía tres pares de cebadores en cada ronda de amplificación para la detección, tipificación y subtipificación simultáneas de los virus de influenza tipo A (H3N2 y H1N1) y tipo B en una vigilancia prospectiva de influenza en Inglaterra en el Temporada de invierno 1995–1996 (30). Se analizó un total de 619 muestras combinadas de frotis de nariz y garganta de pacientes con una enfermedad similar a la influenza mediante cultivo y PCR multiplex. La RT-PCR múltiplex detectó virus de influenza en 246 (39,7 %) muestras en comparación con las 200 (32,3 %) que arrojaron virus de influenza en cultivo. Además, hubo una excelente correlación entre la RT-PCR multiplex y el cultivo para la tipificación y subtipificación de los virus de la influenza (100 %) y para la detección temporal de los virus de la influenza A H3N2 y H1N1. Se concluyó que, si bien la RT-PCR multiplex demostró su utilidad en la detección de virus de influenza en pacientes con enfermedad similar a la influenza, los pacientes con enfermedad similar a la influenza que son negativos para los virus de influenza pueden albergar patógenos que producen un síndrome difícil de detectar. distinguir clínicamente de la influenza verdadera (por ejemplo, RSV). De hecho, cuando esta RT-PCR multiplex se modificó para que fuera capaz de detectar y subtipificar los virus de la influenza A (H1N1 y H3N2) y B, así como los subtipos A y B del RSV en muestras clínicas respiratorias (98), el ensayo volvió a demostrar una correlación excelente (100 %) con los resultados del cultivo y la serología. También se demostró la capacidad de la prueba para detectar la coinfección viral tanto en muestras simuladas como en muestras clínicas.

Se desarrolló una RT-PCR multiplex anidada usando tres pares de cebadores para detectar los tipos 1, 2 y 3 de PIV en frotis faríngeos y nasofaríngeos (27). En la primera ronda de amplificación, se producen fragmentos de tamaño similar. En la segunda ronda de amplificación, se introducen una serie de tres pares de cebadores internos, lo que produce amplicones específicos del tipo que se diferenciaron fácilmente según el tamaño mediante electroforesis en gel. La prueba detectó y tipificó correctamente el PIV en 15 aislamientos y 26 de 30 (87 %) muestras nasofaríngeas previamente positivas, pero siguió siendo negativa en muestras naso u orofaríngeas y/o aislamientos de cultivo de 33 patógenos del tracto respiratorio no relacionados. En una versión modificada, la prueba también se usó para detectar RSV y adenovirus utilizando cinco conjuntos de cebadores para amplificar el ADNc de los subtipos A y B de RSV; PIV tipos 1, 2 y 3; y ADN de adenovirus tipos 1 a 7 (74). La prueba fue sensible y específica para los 12 virus prototipo cultivados en cultivo de tejidos y cuando se aplicó a muestras respiratorias fue más sensible (41 de 112) que la inmunofluorescencia directa o la detección de antígenos después del cultivo (34 de 112). Entre las muestras positivas, se encontraron múltiples virus respiratorios en cuatro especímenes, lo que ilustra aún más la utilidad potencial de este ensayo de PCR multiplex.

Un ensayo de hibridación enzimática de RT-PCR cuantitativa multiplex (Hexaplex; Prodesse, Inc., Milwaukee, Wis.) que combina cebadores que se originan en regiones altamente conservadas de 7 virus respiratorios (RSV subtipos A y B; PIV tipos 1, 2 y 3; y los virus de la influenza A y B) con sondas para la detección de productos de PCR usando el ensayo de hibridación enzimática también se ha descrito (33). El ensayo proporciona detección, identificación y cuantificación rápidas y simultáneas de estos virus en muestras de lavado nasal en una sola prueba. El cebador y las sondas utilizadas se evaluaron utilizando múltiples aislados de virus de cada grupo y dieron como resultado productos de PCR específicos de todos los especímenes positivos en cultivo de tejidos sin reactividad cruzada entre estos siete virus o con otros virus respiratorios humanos comunes. El ensayo Hexaplex se aplicó en muestras de lavado nasal de 69 niños con signos de infección del tracto respiratorio inferior y 40 muestras de niños asintomáticos. De los 69 especímenes de niños sintomáticos, 37 fueron positivos por el ensayo Hexaplex, pero solo 29 de ellos fueron positivos por cultivo. Tanto el ensayo Hexaplex como el cultivo del virus fueron negativos en los 40 lavados nasales de los niños asintomáticos. El ensayo Hexaplex fue 100 % sensible y 98 % específico en comparación con el cultivo de virus.

La PCR multiplex en combinación con un ensayo de cambio de movilidad heterodúplex ha demostrado ser una herramienta valiosa y rentable para monitorear la aparición de nuevas variantes o nuevos subtipos de virus de influenza que surgen a través de los fenómenos de deriva antigénica y cambio antigénico (125,126). Sobre la base del tamaño del amplicón, el ensayo de amplificación diferencia la región variable de los genes de hemaglutinina de los subtipos H1 y H3 de los virus de la influenza A y B y la contraparte (hemaglutinina, esterasa y gen de fusión) del virus de la influenza C. Variantes dentro de la A continuación, se identifica el mismo tipo o subtipo mediante un ensayo de cambio de movilidad heterodúplex de los amplicones. Este enfoque demostró ser un método rápido, sensible y confiable para la detección y tipificación del virus de la influenza y para la detección de variantes del virus de la influenza, demostrando ser capaz de identificar nuevas variantes del virus de la influenza B (126).

Más recientemente, se ha demostrado que la PCR multiplex es una herramienta diagnóstica útil y rápida para el manejo de niños con infecciones respiratorias agudas.36). Esta PCR multiplex de inicio en caliente simplificada permite la detección simultánea de nueve agentes infecciosos diferentes (enterovirus, virus de influenza A y B, RSV, PIV tipos 1 y 3, adenovirus,micoplasma pneumoniae, yclamidia neumonía). La prueba se evaluó utilizando muestras clínicas de 1.118 niños con infecciones respiratorias agudas y dio positivo en 395 (35%) muestras. De estos, el 37,5% fueron positivos para RSV, el 20% fueron positivos para virus influenza A, el 12,9% fueron positivos para adenovirus, el 10,6% fueron positivos para enterovirus, el 8,1% fueron positivos paraM. pneumoniae, el 4,3% fueron positivos para PIV tipo 3, el 3,5% fueron positivos para PIV tipo 1, el 2,8% fueron positivos para el virus de la influenza B y el 0,2% fueron positivos paraChlamydia trachomatis. Se observaron variaciones estacionales en las tasas de detección de los diferentes organismos. La prueba demostró niveles de concordancia del 95 % para el RSV y del 98 % para el virus de la influenza A con los datos obtenidos por inmunoensayo enzimático comercialmente disponible.

Infecciones genitourinarias

La utilidad de la PCR multiplex en el diagnóstico de virus asociados con la infección del tracto genital se refleja en los numerosos informes que detectan y tipifican los virus del papiloma humano (VPH). Estas PCR multiplex tienen una variedad de formatos pero con el objetivo común de detectar y tipificar los VPH. Estos incluyen PCR que combinaron cebadores para producir un tamaño de producto específico del tipo (97,103) o aquellos que utilizaron cebadores degenerados para la detección del VPH y cebadores antisentido específicos de la cepa para la tipificación simple (56). En un protocolo alternativo, tres pares de cebadores de consenso detectaron simultáneamente VPH tipo 16 (VPH-16) y VPH-18 de alto riesgo (para carcinoma de cuello uterino) y VPH-6 y VPH-11 de bajo riesgo, y pares de cebadores para más de 40 se desarrollaron otros tipos de VPH (consensus multiplex PCR) (124). Se consideró que este enfoque era un ensayo de PCR multiplex de consenso porque todos los cebadores son consenso y se multiplexan en la misma mezcla de PCR para la amplificación simultánea. Un par de cebadores amplifica el ADN general del VPH de más de 40 tipos, incluidos los VPH-6, -11, -16 y -18 (producto de PCR de 450 pb), lo que indica una infección por VPH. Otro par de cebadores genera un producto de PCR de 307 pb si el ADN de HPV-16 y -18 está presente en la muestra (infección por HPV de alto riesgo). El tercer par de cebadores de consenso da como resultado un producto de PCR de 550 pb con infección por VPH de bajo riesgo (VPH-6 y -11). El ensayo se evaluó en muestras de células exfoliadas obtenidas de 148 mujeres sanas, muestras de biopsia de 32 pacientes con condiloma acuminado y muestras de biopsia de 76 pacientes con carcinoma invasivo del cuello uterino. La PCR multiplex fue positiva en 47 (31,8 %) de las muestras de las 148 mujeres sanas, pero la mayoría de las muestras positivas fueron en muestras de mujeres infectadas con tipos de VPH distintos al VPH-6 y -11 o VPH-16 y -18 . Todas las muestras de pacientes con condiloma acuminado contenían ADN del VPH, pero principalmente VPH-6/11 (87,5 %), mientras que el VPH de alto riesgo tenía una tasa de prevalencia baja (6,5 %). Se detectaron VPH en muestras de 69 (90,8 %) de las 76 pacientes con carcinoma de cuello uterino, de las cuales los VPH de alto riesgo representaron el 82,9 %. El método demostró ser una herramienta simple, económica y confiable para la detección de la infección por VPH. La amplificación simultánea de los tres objetivos del VPH debería permitir un enfoque rápido para distinguir los tipos de VPH relacionados con la enfermedad: VPH de bajo riesgo (VPH-6 y VPH-11) involucrados en lesiones genitales benignas, como verrugas o condilomas, y VPH de alto riesgo. VPH (VPH-16 y VPH-18), que se encuentran con frecuencia en lesiones malignas del tracto genital inferior. Esto debería proporcionar información valiosa para monitorear y tratar pacientes con lesiones relacionadas con el VPH, aunque el método carece de la capacidad de definir tipos individuales de VPH, lo que limita su utilidad en investigaciones epidemiológicas.

Se utilizaron tres cebadores de consenso (dos cebadores sentido y 1 cebador antisentido marcado con dinitrofenilo) en un ensayo de PCR multiplex para la detección y tipificación de tipos de VPH oncogénicos y no oncogénicos (23). Los productos de amplificación se hibridaron con oligosondas marcadas específicas mezcladas en dos cócteles (oligosondas de VPH biotiniladas oncogénicas y no oncogénicas) que luego podrían depositarse en un pocillo de microplacas recubiertas con estreptavidina. Los productos de PCR se detectaron con anticuerpo monoclonal anti-dinitrofenilo y peroxidasa de rábano picante (PCR-inmunoensayo enzimático). La prueba se evaluó en raspados cervicales de 181 pacientes con alto riesgo de cáncer de cuello uterino seleccionadas por sus antecedentes de anomalías citológicas y/o histológicas cervicales y vaginales. Estos pacientes se clasificaron con respecto a la presencia de lesiones en los raspados cervicales como ninguno (es decir, sin lesiones;norte= 137), bajo grado (es decir, pocas lesionesnorte= 20) y de alto grado (es decir, muchas lesionesnorte= 24). En pacientes sin lesiones, la PCR multiplex detectó VPH no oncogénicos en 29 pacientes (18,3 %) y VPH oncogénicos en 44 pacientes (32,1 %), incluidos 21 (15,3 %) pacientes con coinfección. En el grupo de bajo grado, se detectó VPH oncogénico en 12 pacientes (60 %) y VPH no oncogénico en 5 pacientes (25 %), incluidos 4 (20 %) casos de coinfección. En los pacientes de alto grado se detectaron VPH oncogénicos en el 95,8% (23 pacientes) con coinfección por VPH no oncogénicos en 4 de estos pacientes (16,7%). La PCR multiplex fue negativa en los raspados de los 93 pacientes restantes (85 pacientes sin lesiones, 7 pacientes en el grupo de bajo grado y 1 paciente en el grupo de alto grado). Los autores concluyeron que la prueba es simple y reproducible y puede automatizarse.

Otra variación (75) combinaron una PCR multiplex anidada, utilizando cebadores específicos para tipos de VPH de bajo o alto riesgo con análisis de endonucleasas de restricción. La precisión de este enfoque se confirmó examinando raspados cervicales de 44 pacientes. Los VPH se detectaron y tipificaron en raspados de 7 pacientes con coilocitosis, 8 pacientes con displasia o metaplasia, 3 pacientes con condiloma acuminado y 18 pacientes con neoplasia cervical invasiva, pero en ninguna muestra de los siete controles sanos. Más recientemente, se ha desarrollado una PCR múltiplex simple que utiliza tres pares de cebadores para la amplificación de HPV-16, -18 y -33 en combinación con una hibridación colorimétrica en microplacas como sistema de detección posterior a la PCR (35). El sistema utiliza tres oligonucleótidos de captura específicos de tipo unidos covalentemente a un solo pocillo de microplaca y tres sondas multibiotiniladas específicas de tipo para la detección. La metodología se evaluó utilizando un total de 55 frotis cervicales y muestras de biopsias de 55 mujeres con lesiones cervicales, lo que resultó en una correlación del 100 % con los resultados de otras PCR utilizando cebadores de consenso.

Una PCR multiplex que combinó la detección deC. trachomatisy se desarrollaron, optimizaron y evaluaron dos virus (HPV y HSV) utilizando muestras cervicales y endocervicales de pacientes con sospecha de infección con uno o más de estos agentes (64). La prueba produjo una correlación del 100% con los resultados de las PCR uniplex en 92 hisopos genitales (29 fueron positivos para HSV, 16 fueron positivos para HPV y uno fue positivo paraC. trachomatis). Además, la PCR multiplex detectó una coinfección por VPH y VHS. En otros estudios (7,66,73), los pares de cebadores para HSV se combinaron con los deHaemophilus ducreyiyTreponema pálidopara construir una PCR multiplex para el diagnóstico de ulceración genital. Los productos de PCR se detectaron utilizando un sistema de detección colorimétrica en el que se usaron tres micropocillos separados que contenían sondas de captura de oligonucleótidos inmovilizados. En uno de estos estudios (73), la sensibilidad de esta PCR multiplex en 298 muestras de hisopos de úlceras genitales para detectar el VHS,H. ducreyi, yT pálidofueron 100, 98,4 y 91%, respectivamente, en comparación con 71,8, 74,2 y 81% por cultivo de HSV,H. ducreyicultivo y microscopía de campo oscuro paraT pálido, respectivamente. Se utilizó la misma PCR multiplex para evaluar muestras de hisopos de 38 pacientes secuenciales con úlceras genitales que recibieron diagnósticos clínicos y tratamiento sindrómico (7). Estos especímenes también fueron probados paraH. ducreyipor cultivo que resultó negativo para todas las muestras analizadas. De los 38 especímenes, la PCR multiplex detectó HSV en 31 especímenes (81,6%) y HSV yT pálidoen 1 muestra (2,3%) (coinfección). La prueba fue negativa en los seis especímenes restantes (15,8%). Los diagnósticos clínicos se correspondían pobremente con los resultados de la PCR multiplex para chancroide y sífilis; ninguna de las muestras de los seis casos sospechosos de chancroide y el único caso de sífilis fueron positivas paraH. ducreyiyT pálido, respectivamente, por la PCR multiplex. De los seis casos clínicamente sospechosos de chancroide, la PCR multiplex fue negativa para todos los patógenos en un caso y positiva para HSV en los cinco casos restantes. De 24 casos clínicamente sospechosos de herpes genital, 21 casos (87,5%) fueron confirmados por PCR multiplex.

Aunque los hallazgos clínicos se correlacionaron mal con los resultados de la PCR multiplex, se sabe que las manifestaciones clínicas de las tres infecciones pueden variar significativamente.25). Algunas muestras produjeron resultados negativos para los cuales puede haber varias explicaciones posibles, incluidas úlceras debidas a traumatismos, número bajo de organismos, técnicas de muestreo inadecuadas y lesiones debidas a otros agentes etiológicos. Estos estudios resaltan las ventajas de la PCR multiplex sobre las técnicas estándar de laboratorio y permiten la detección de la coinfección.

Infecciones Oculares

Los beneficios del diagnóstico por PCR sobre las técnicas convencionales en el diagnóstico de infecciones oculares están bien documentados tanto para el segmento anterior como posterior del ojo (1,24,31,80). El desarrollo y evaluación de PCR multiplex para la detección de adenovirus, HSV yC. trachomatisen casos de queratoconjuntivitis demostró la viabilidad de la detección simultánea de estos agentes (49; A. C. Yeo, R. J. Cooper, D. J. Morris y C. C. Storey, Abstr. Reunión de la 97.ª generación. Soy. Soc. Microbiol., abstr. C-416, 1997). Estos estudios resaltan aún más las dificultades de la PCR multiplex y también proporcionan pruebas sustanciales de la importancia de una selección cuidadosa de los cebadores de oligonucleótidos. En el estudio de Jackson et al. (49), se diseñó una PCR multiplex para detectar adenovirus y HSV en hisopos oculares. La prueba produjo resultados idénticos a los del aislamiento del virus en 18 de 20 frotis oculares (positivo para adenovirus en cinco frotis, positivo para HSV en cinco frotis y negativo para adenovirus y HSV en ocho frotis), pero las dos muestras restantes dieron positivo para adenovirus y HSV por aislamiento del virus dieron negativo por PCR multiplex. Sin embargo, la PCR multiplex demostró ser superior al cultivo para el diagnóstico rápido de la queratoconjuntivitis viral. Reemplazo del par de cebadores de adenovirus para permitir una reactividad más amplia con los serotipos de adenovirus e inclusión de un par de cebadores dirigidos al plásmido críptico deC. trachomatis(A. C. Yeo, R. J. Cooper, D. J. Morris y C. C. Storey, Abstr. 97th Gen. Meet. Am. Soc. Microbiol., abstr. C-146, 1997) produjeron una PCR triplex multiplex. La sensibilidad de este adenovirus-HSV-C. trachomatisPCR multiplex en comparación con PCR uniplex para la detección de adenovirus fue del 100%. Sin embargo, el rendimiento de la prueba para detectar HSV oC. trachomatisfue relativamente pobre (69 % en comparación con el cultivo celular o 72 % en comparación con una técnica de detección de antígenos). Selección de HSV alternativo yC. trachomatislos pares de cebadores permitieron el desarrollo de una PCR multiplex con una sensibilidad idéntica a la de las PCR uniplex para la detección de cada uno de los tres objetivos.

Pacientes inmunocomprometidos

Debido a la importancia de las infecciones por HHV en pacientes inmunocomprometidos, varios autores han desarrollado métodos para la detección simultánea de estos virus en diversas muestras clínicas. Se detectaron dos genes diferentes de CMV con una PCR multiplex de un solo paso en muestras clínicas de receptores de trasplantes renales y otros pacientes seropositivos para CMV.11). La prueba fue sensible y permitió el seguimiento de la infección por CMV mediante la cuantificación del ADN de CMV. Este último se basó en la suposición de que es más probable que las muestras con pequeñas cantidades de ADN viral conduzcan a la amplificación de solo uno de los dos objetivos. Las muestras a partir de las cuales se amplifica un solo objetivo contienen en promedio siete veces menos genomas virales por cada 10⁶leucocitos que aquellos a partir de los cuales se amplifican ambas dianas. Este enfoque se evaluó en muestras de ADN de leucocitos en serie tomadas de 34 pacientes durante las primeras 12 semanas posteriores al trasplante renal, y se concluyó que los hallazgos de tres pruebas consecutivas en las que se amplificaron ambos objetivos del CMV eran altamente indicativos de pacientes que habían desarrollado un alta carga de CMV con una sensibilidad del 100% y una especificidad del 88%. Por lo tanto, el protocolo se puede utilizar para la identificación eficaz de los receptores de trasplantes en riesgo de infección clínicamente significativa. Se utilizó un formato de PCR similar para desarrollar una PCR multiplex para la amplificación de cuatro regiones diferentes del genoma del CMV (61). La sensibilidad de la prueba para la detección de ADN de células genómicas infectadas con CMV fue similar a la obtenida por cada par de cebadores (PCR uniplex). La prueba demostró tener una alta utilidad diagnóstica para la detección de variantes de CMV con máxima sensibilidad y especificidad.

En los receptores de trasplante de corazón se utilizó una PCR multiplex anidada de inicio en caliente para evaluar la posible reactivación de HHV-6 y HHV-7 (67). La prueba también se combinó con el ensayo de antigenemia de CMV y el aislamiento de HSV. La PCR multiplex se realizó en muestras de capa leucocitaria y de plasma de los 21 receptores y en muestras de capa leucocitaria de donantes de sangre sanos. Mientras que 12 de 21 (57,1 %) receptores de trasplante cardíaco mostraron reactivación de CMV y/o HSV, HHV-6 se detectó en 2 de 21 (9,5 %) de los receptores y en 7 de 56 (12,5 %) donantes de sangre. El ADN del HHV-7 se detectó en 13 de los 21 receptores (61,9 %) y en 30 de los 56 (56,6 %) donantes de sangre. Uno de los pacientes positivos para HHV-6 y 10 de los positivos para HHV-7 fueron positivos para CMV. Queda por determinar la importancia clínica de estas infecciones concurrentes, pero su detección destaca aún más la utilidad de la PCR multiplex en la investigación de pacientes trasplantados.

También se ha descrito la detección y tipificación de todos los herpesvirus linfotrópicos humanos (EBV, CMV, HHV-6 variantes A y B, HHV-7 y HHV-8) utilizando pares de cebadores diseñados para amplificar una región altamente conservada dentro del gen de la ADN polimerasa (77). La prueba también incluyó un control interno (100 moléculas de un fragmento clonado del genoma del herpesvirus de la pseudorrabia porcina) para la detección de resultados falsos negativos. La prueba reveló una sensibilidad de 10 a 100 moléculas de ADN de cada virus y produjo una correlación del 100 % en un total de 35 muestras bien caracterizadas en las que se sabía que estaba presente uno de estos virus, incluidas las lesiones cutáneas del sarcoma de Kaposi y suero, LCR , muestras de saliva y orina.

Detección simultánea de EBV y los protozoosToxoplasma gondiien el líquido cefalorraquídeo de pacientes con SIDA con linfoma del sistema nervioso primario asociado al VEB y encefalitis por toxoplasma (87). Esta PCR multiplex detectó ADN de EBV en 9 de 14 pacientes con linfoma del SNC y en 2 de 38 pacientes sin enfermedad yT. gondiiADN en 8 de 8 pacientes con encefalitis por toxoplasma pero en ninguno sin toxoplasmosis.

El principal problema con el uso de PCR en muestras de pacientes inmunocomprometidos es la relación de los resultados positivos con la enfermedad clínica. Esto es particularmente difícil con los herpesvirus, porque los resultados positivos de la PCR no siempre van acompañados de signos o síntomas en el paciente. Esto puede dejar al médico en un dilema de si tratar o no. Se han utilizado dos enfoques para abordar este problema. La PCR cuantitativa se puede usar para medir la carga viral con la expectativa de que una carga viral alta probablemente anuncie una enfermedad clínica. El otro enfoque es analizar muestras secuenciales y solo recomendar el tratamiento si persisten los resultados positivos en lugar de responder a lo que puede ser una reactivación transitoria de un herpesvirus. La PCR multiplex se puede aplicar fácilmente a la última situación, pero la PCR cuantitativa multiplex sigue siendo un desafío tecnológico formidable.

Otras aplicaciones

Varios estudios han utilizado PCR multiplex para la detección y diferenciación de retrovirus humanos (45,46,99,111). Se combinaron cuatro pares de cebadores para detectar lamordazaregión del VIH tipo 1 (VIH-1), laenvregión del VIH-2, lapolíticoregión del virus de la leucemia de células T humanas tipo 1 (HTLV-1), y laimpuestoregión de HTLV-2 (45). Los amplicones se detectaron por hibridación líquida usando³²Oligonucleótidos marcados en el extremo P. En la evaluación de un panel serológicamente bien establecido de individuos con una o dos infecciones, el ensayo detectó 21 de 22 infecciones por VIH-1, 8 de 10 por VIH-2, 8 de 8 por HTLV-1 y 8 de 8 por HTLV-2. La prueba fue tan sensible como las PCR uniplex y permitió la detección de coinfección. Sunzeri et al. (99) desarrolló una PCR multiplex utilizando pares de cebadores dirigidos a una porción de lamordazaregión del VIH-1, lapolíticogen de HTLV-1 y -2, y una región del locus HLA-DQ-α como control interno. Los productos se analizaron mediante cromatografía de ADN capilar automatizada (los productos también se pueden separar y visualizar mediante electroforesis en gel y tinción con bromuro de etidio). La prueba detectó de 1 a 10 células infectadas (de 2 a 20 secuencias diana) y fue tan sensible como las PCR uniplex.

Varios estudios han destacado el uso potencial de la PCR en la detección de virus transmitidos por transfusiones de sangre donada (48), pero la necesidad de múltiples ensayos de PCR discretos para lograr este propósito ha restringido dicha aplicación. Uniplex PCR sería un enfoque poco práctico para la detección rápida de cientos de muestras por día para una variedad de virus transmitidos por transfusión. Multiplex PCR presenta una solución más práctica al problema, y ​​la metodología es lo suficientemente sensible para diagnosticar portadores silenciosos (serológicamente negativos) de virus como el VIH, HTLV y otros virus transmitidos por transfusiones no retrovirales, incluido el virus de la hepatitis B (VHB), VHC. y CMV.

Multiplex PCR ofrece una solución rentable que, con refinamiento y automatización completa, permitiría la detección del suministro de sangre donada. De hecho, un estudio reciente (106) demostró la promesa de la automatización de PCR multiplex para la detección rápida y confiable de virus transmitidos por transfusiones en sangre donada y tejidos trasplantables. Se desarrolló una PCR múltiplex de inicio en caliente para identificar y determinar la abundancia de VIH-1, VIH-2 y HTLV-1 y -2. Las secuencias de ADN viral se amplificaron en una sola reacción y los amplicones resultantes se detectaron en tiempo real mediante la hibridación de cuatro sondas detectoras específicas de amplicón de diferentes colores llamadas balizas moleculares presentes dentro del mismo tubo de reacción. El color de la fluorescencia producida durante el proceso de amplificación identificó el retrovirus presente en la muestra, y la correlación de los ciclos térmicos requeridos con la intensidad de cada señal fluorescente desarrollada proporciona una medida precisa del número de secuencias de virus presentes en la muestra original. La prueba tuvo una sensibilidad de 10 genomas retrovirales en presencia de 100.000 copias de otro retrovirus, y se pueden analizar hasta 96 muestras en 3 h en una sola placa. La prueba también se evaluó usando 43 muestras de sangre humana que contenían retrovirus humanos y produjo un 100 % de concordancia en 11 muestras positivas para VIH-1, 4 muestras positivas para VIH-2, 15 muestras positivas para HTLV-1 y 17 muestras positivas para HTLV-2 y las 10 muestras de control permanecieron negativas para todos los objetivos.

También han aparecido en la literatura PCR multiplex para otros virus transmitidos por transfusiones. Se ha desarrollado una PCR multiplex que detecta las secuencias genómicas de HBV y HBC en muestras de suero (71). La prueba se realiza en dos etapas. El ARN del VHC primero se transcribe de forma inversa en ADNc y, a continuación, tanto el ADNc del VHC como el ADN del VHB se coamplifican utilizando cebadores que se dirigen a las secuencias conservadas de ambos virus. La prueba se aplicó a sueros de nueve donantes, de los cuales siete resultaron positivos para HBsAg, anti-HBc y anti-HCV; uno fue reactivo tanto para anti-HCV como para anti-HBc; y uno fue reactivo tanto para HBsAg como para anti-HBc. La PCR multiplex produjo resultados que confirmaron la presencia de secuencias genómicas específicas tanto del VHB como del VHC en ocho de ocho sueros reactivos para los marcadores serológicos de ambos virus y también en un suero que solo era reactivo para los marcadores del VHB. El método se modificó para incluir cebadores dirigidos a la región no traducida 5' del VHC y la región pre-S y S del VHB en un método de PCR múltiplex de un solo paso. Esta modificación permitió una simple amplificación simultánea de ambos virus con 100% de concordancia con sus respectivas PCR uniplex (47).

Los genomas del VHC y del virus GB tipo C (GBV-C)/HGV en muestras de plasma de sujetos transfundidos también se han amplificado mediante PCR multiplex (dieciséis). La prueba se evaluó retrospectivamente en 50 muestras de plasma en comparación con los resultados de la serología. De las 50 muestras, 40 dieron positivo para anti-HCV y 10 muestras permanecieron negativas para anticuerpos. La PCR multiplex y la PCR uniplex correspondiente dieron resultados idénticos, siendo positivos para ARN del VHC en 32 muestras de las 40 muestras positivas para anti-VHC. GBV-C RNA se detectó en 5 de las 32 muestras VHC positivas (coinfección) y en 2 de 10 muestras que fueron anti-VHC negativas. La aplicación más generalizada de la PCR multiplex destinada a detectar virus y/u otros patógenos transmitidos por transfusiones exigirá una optimización exhaustiva y una automatización total de los procedimientos para evitar la producción de resultados falsos positivos y falsos negativos. Las demandas de la medicina transfusional de cribado de alta velocidad y alto rendimiento impondrán grandes exigencias técnicas a estos procedimientos.

La metodología de PCR multiplex también ha demostrado ser una herramienta valiosa para la diferenciación, subagrupación, subtipificación y genotipificación de virus (10,29,78,84,121). La diferenciación de los poliovirus de los enterovirus que no son poliovirus tanto en muestras clínicas (heces) como ambientales (aguas residuales) ha sido factible mediante el uso de RT-multiplex PCR.29). Los especímenes de heces o aguas residuales se inoculan primero en cultivos celulares en tubos y, después de una incubación durante la noche, los cultivos se someten a RT-multiplex PCR. Se ensayó un par de cebadores que detectaba todos los enterovirus en presencia de otros dos pares de cebadores específicos para los poliovirus. El par de cebadores específicos de enterovirus generó un tamaño de producto de 300 pb, y los pares de cebadores específicos de poliovirus generaron tres productos de PCR diferentes de 200, 600 y 1000 pb, lo que garantiza una fácil identificación en geles de agarosa. El resultado se interpreta como "enterovirus no polio" si solo se observa el producto de PCR específico de enterovirus (300 pb); como “poliovirus” si se observan tanto el producto específico de enterovirus (300 pb) como al menos uno de los productos específicos de polio (200, 600 y 1000 pb); o como “sin enterovirus” si la PCR multiplex sigue siendo negativa para todos los productos. Un total de 36 cepas de poliovirus produjeron los resultados esperados por PCR multiplex, compatibles con poliovirus, y solo un aislado (coxsackievirus A21) de 45 cepas que no eran de poliovirus mostró una banda con un par de cebadores específicos de poliovirus. El protocolo reveló una sensibilidad de 3 UFP, podía interpretarse en 24 h y era muy insensible a las sustancias de la muestra (heces y aguas residuales) que inhiben el aislamiento del cultivo celular.

Se ha descrito una RT-PCR multiplex que identifica simultáneamente las cepas vacunales de los tipos 1, 2 y 3 del poliovirus Sabin (10). Esta PCR multiplex basada en arranque en caliente fue una modificación de un procedimiento descrito anteriormente (121). El ensayo utilizó tres conjuntos de cebadores específicos de serotipo que se asignan a la región del genoma del poliovirus que codifica el extremo amino de la proteína de la cápside VP1, una región conocida por su heterogeneidad entre los tres serotipos del poliovirus Sabin. En un total de 195 muestras de heces recolectadas de 26 vacunados luego de la administración de la primera dosis de la vacuna oral trivalente, la PCR múltiple fue más sensible que el cultivo para la detección de poliovirus tipos 1, 2 y 3. Los porcentajes de muestras positivas por las PCR multiplex para los serotipos 1, 2 y 3 fueron 67,2, 82,6 y 53,8%, respectivamente, frente a 55,4, 64,1 y 27,7% por aislamiento viral. La duración de la recuperación de muestras positivas por PCR varió según el serotipo: de 4 a 8 semanas para el tipo 2 y de 1 a 8 semanas para los tipos 1 y 3, aunque la diseminación del poliovirus tipo 3 cesó en aproximadamente el 70% de los vacunados dentro de la semana posterior a la inmunización. Esta PCR multiplex modificada permite la caracterización directa del virus en muestras de heces sin cultivo celular, un proceso que puede, a través de la selección de variantes genéticas, no representar con precisión la población del virus en las muestras originales.

Se detectaron adenovirus humanos en muestras clínicas con seis pares de cebadores específicos para todos los subgéneros de adenovirus (A a F) (78). Cada par de cebadores consta de un cebador derivado de las secuencias específicas del subgénero y un cebador que se dirige a una región de hexón conservada, lo que evita la necesidad de un análisis de endonucleasas de restricción. Los seis amplicones específicos de subgénero se distinguieron mediante electroforesis en gel de agarosa como productos de 299, 465, 269, 331, 399 y 586 pb que representan, respectivamente, los del subgrupo A a F de adenovirus. La prueba reveló un límite de detección de una sola copia de ADN de adenovirus. Los pares de cebadores produjeron una especificidad del 100 % cuando se evaluaron en 23 prototipos de adenovirus, que representan los seis subgéneros; en 9 cepas intermedias de los subgéneros B y D; y en 16 tipos de genoma del subgénero C. En muestras clínicas, la prueba fue positiva para adenovirus en 26 de 65 muestras de heces (4 muestras pertenecientes al subgrupo A, 2 muestras pertenecientes al subgrupo B, 6 muestras pertenecientes al subgrupo C, 13 muestras pertenecientes al subgrupo F y 1 muestra con coinfección con el subgrupo C y F), en 13 de 23 muestras de ojos (1 muestra perteneciente al subgrupo B, 10 muestras pertenecientes al subgrupo D y 2 muestras pertenecientes al subgrupo E) y 2 de 12 muestras de garganta (pertenecientes al subgrupo B de adenovirus) . Cabe destacar que la prueba tiene valor clínico, como puede destacarse por su discriminación del subgrupo D de adenovirus, que causa la queratoconjuntivitis epidémica grave y altamente contagiosa, de los adenovirus de los subgrupos B y E, que pueden causar infecciones oculares relativamente leves. La prueba también podría facilitar la clasificación primaria de aislados de virus desconocidos.

La PCR multiplex también ha demostrado ser una herramienta valiosa para el genotipado de cepas de VHB (84). La primera ronda de amplificación utiliza un par de cebadores para amplificar toda la región pre-S del genoma del virus. Dentro de la región pre-S se observan intercambios de nucleótidos que están parcialmente correlacionados con los subtipos de antígenos de superficie serológicos. En la segunda ronda de amplificación, se agregan cinco cebadores adicionales específicos de subtipo y dos cebadores universales no específicos de grupo para generar de dos a cuatro fragmentos de ADN de tamaños definidos indicativos del subtipo. El método demostró ser una herramienta epidemiológica útil para estudiar la transmisión del VHB y puede adaptarse a genomas de otros agentes infecciosos que demuestren un grado adecuado de variabilidad de secuencia.

Otras aplicaciones de la PCR multiplex incluyen maximizar la inclusividad de los ensayos basados ​​en PCR para detectar cepas virales (11,51,61,93), explorando el reordenamiento genético entre virus (90), estudiando la asociación del virus con la enfermedad (105), estudiando la patogenia del virus (6), explorando mecanismos de evasión de virus e interferencia con la respuesta inmune del huésped (41), y facilitando la detección y caracterización de virus y otros patógenos retrospectivamente en diversos especímenes de archivo de volúmenes limitados (2). Además, la metodología ha demostrado ser una poderosa herramienta para la caracterización de virus no humanos (50,70,85,104,114,116).

1.Adleberg J M, Wittwer C. Uso de la reacción en cadena de la polimerasa en el diagnóstico de enfermedades oculares.Curr Opin Oftalmol.1995;6:80–85.[PubMed][Google Académico]

2.Bakaletz L O, White G J, Post J C, Ehrlich G D. Análisis de PCR multiplex cegados del oído medio y el líquido nasofaríngeo de modelos de chinchilla de otitis media inducida por patógenos únicos y mixtos.Clin Diagn Lab Immunol.1998;5:219–224. [Artículo gratuito de PMC][PubMed][Google Académico]

3.Beards G, Graham C, Pillay D. Investigación de erupciones vesiculares para HSV y HZV por PCR.JMed Virol.1998;54:155–157.[PubMed][Google Académico]

4.Bej A K, Mahbubani M H, Atlas R M. Amplificación de ácidos nucleicos por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y otros métodos y aplicaciones.Crit Rev Biochem Mol Biol.1991;26:301–334.[PubMed][Google Académico]

5.Belli A, Rodriguez B, Aviles H, Harris E. Detección simplificada de la reacción en cadena de la polimerasa del nuevo mundoLeishmaniaen muestras clínicas de leishmaniasis cutánea.Soy J Trop Con Hyg.1998;58:102–109.[PubMed][Google Académico]

6.Bertram S, Hufert F T, van Lunzen J, von Laer D. La coinfección de leucocitos individuales con el citomegalovirus humano y el virus de la inmunodeficiencia humana es un evento rarovivir.JMed Virol.1996;49:283–288.[PubMed][Google Académico]

7.Beyrer C, Jitwatcharanan K, Natpratan C, Kaewvichit R, Nelson K E, Chen C Y, Weiss J B, Morse S A. Métodos moleculares para el diagnóstico de la enfermedad de la úlcera genital en una población clínica de enfermedades de transmisión sexual en el norte de Tailandia: predominio del herpes simple contagio de virus.J Infecciones Dis.1998;178:243–246.[PubMed][Google Académico]

8.Birch DE, Kolmodin L, Wong J, Zangenberg G A, Zoccoli M A, McKinney N, Young K K Y. PCR simplificada de inicio en caliente.Naturaleza.1996;381:445–446.[PubMed][Google Académico]

9.Brownie J, Shawcross S, Theaker J, Whitcombe D, Ferrie R, Newton C, Little S. La eliminación de la acumulación de dímeros de cebadores en PCR.Ácidos Nucleicos Res.1997;25:3235–3241. [Artículo gratuito de PMC][PubMed][Google Académico]

10Buonagurio D A, Coleman J W, Patibandla S A, Prabhakar B S, Tatem J M. Detección directa de cepas de la vacuna del poliovirus Sabin en muestras de heces de vacunados con la primera dosis mediante un método sensible de PCR con transcripción inversa.J. Clin Microbiol.1999;37:283–289. [Artículo gratuito de PMC][PubMed][Google Académico]

11Knight OL, Menezes CLP, Costa MCSL, Fernandes SC, Anacleto TM, De Oliveira RM, Viotti EA, Tavora ERF, Vilaca SS, Sabbaga E, De Paula FJ, Tavora PF, Villa LL, Simpson AJG PCR de un solo paso de alta sensibilidad protocolo para el diagnóstico y seguimiento de la infección por citomegalovirus humano en receptores de trasplante renal.J. Clin Microbiol.1997;35:3192–3197. [Artículo gratuito de PMC][PubMed][Google Académico]

12Casas I, Tenorio A, Echevarria J M, Klapper PE, Cleator G M. Detección de ARN enteroviral y ADN específico de herpesvirus por amplificación múltiple del genoma.Métodos J Virol.1997;66:39–50.[PubMed][Google Académico]

13Casas I, Pozo F, Trallero G, Echevarria J M, Tenorio A. Diagnóstico viral de infección neurológica por RT multiplex PCR: búsqueda de enterovirus y herpesvirus en un estudio prospectivo.JMed Virol.1999;57:145–151.[PubMed][Google Académico]

14Cassinotti P, Siegl G. Un ensayo de PCR anidado para la amplificación simultánea de los genomas de HSV-1, HSV-2 y HCMV en pacientes con presunta infección herpética del SNC.Métodos J Virol.1998;71:105–114.[PubMed][Google Académico]

15.Cassinotti P, Mietz H, Siegl G. Idoneidad y aplicación clínica de un ensayo de PCR anidado multiplex para el diagnóstico de infecciones por el virus del herpes simple.JMed Virol.1996;50:75–81.[PubMed][Google Académico]

dieciséis.Caudai C, Padula M G, Bettini V, Valensin P E. Detección de infección por VHC y GBV-C/HGV mediante PCR multiplex en muestras de plasma de sujetos transfundidos.Métodos J Virol.1998;70:79–83.[PubMed][Google Académico]

17Cha R S, Thilly W G. Especificidad, eficiencia y fidelidad de la PCR.Aplicación de métodos de PCR1993;3:S18–S29.[PubMed][Google Académico]

18Chamberlain J S, Chamberlain J R. Optimización de PCR multiplex. En: Mullis KB, Ferre F, Gibbs RA, editores.La reacción en cadena de la polimerasa.Boston, Massachusetts: Birkhauser; 1994. págs. 38–46.[Google Académico]

19Chamberlain J S, Gibbs R A, Ranier J E, Nguyen P N, Caskey C T. Multiplex PCR para el diagnóstico de la distrofia muscular de Duchenne. En: Gelfand D H, Innis M A, Shinsky J J, White T J, editores.Protocolos de PCR: una guía de métodos y aplicaciones.San Diego, California: Prensa Académica; 1989. págs. 272–281.[Google Académico]

20Chamberlain J S, Gibbs R A, Ranier J E, Nguyen PN, Caskey C T. Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification.Ácidos Nucleicos Res.1988;dieciséis:11141–11156. [Artículo gratuito de PMC][PubMed][Google Académico]

21Chou Q, Russel M, Birch DE, Raymond J, Bloch W. La prevención del cebado erróneo previo a la PCR y la dimerización del cebador mejora las amplificaciones de bajo número de copias.Ácidos Nucleicos Res.1992;11:1717–1723. [Artículo gratuito de PMC][PubMed][Google Académico]

22Cinque P, Vago L, Marenzi R, Giudici B, Weber T, Corradini R, Ceresa D, Lazzarin A, Linde A. Infecciones por el virus del herpes simple del sistema nervioso central en pacientes infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana: manejo clínico por reacción en cadena de la polimerasa ensayo de líquido cefalorraquídeo.Clin Infect Dis.1998;27:303–309.[PubMed][Google Académico]

23Clavel C, Rihet S, Masure M, Chypre C, Boulanger J C, Quereux C, Birembaut P. DNA-EIA para detectar genotipos de VPH de alto y bajo riesgo en lesiones cervicales con PCR multiplex mediada por cebador E6/E7.J. Clin Pathol.1998;51:38–43. [Artículo gratuito de PMC][PubMed][Google Académico]

24Della N G. Biología molecular en oftalmología: una revisión de principios y avances recientes.Arco Oftalmol.1996;114:457–463.[PubMed][Google Académico]

25DiCarlo R P, Martin D H. El diagnóstico clínico de la enfermedad de úlcera genital en hombres.Clin Infect Dis.1997;25:292–298.[PubMed][Google Académico]

26Dieffenbach C W, Lowe T M J, Dveksler G S. Conceptos generales para el diseño de cebadores de PCR.Aplicación de métodos de PCR1993;3S30–S37.[PubMed][Google Académico]

27Echevarria J E, Erdman D D, Swierkosz E M, Holloway B P, Anderson L J. Detección e identificación simultáneas de virus de parainfluenza humana 1, 2 y 3 a partir de muestras clínicas mediante PCR multiplex.J. Clin Microbiol.1998;36:1388–1391. [Artículo gratuito de PMC][PubMed][Google Académico]

28Edwards M C, Gibbs R A. Multiplex PCR: ventajas, desarrollo y aplicaciones.Aplicación de métodos de PCR1994;3: S65–S75.[PubMed][Google Académico]

29Egger D, Pasamontes L, Ostermayer M, Bienz K. PCR múltiplex de transcripción inversa para la diferenciación entre polio y enterovirus a partir de muestras clínicas y ambientales.J. Clin Microbiol.1995;33:1442–1447. [Artículo gratuito de PMC][PubMed][Google Académico]

30Ellis L, Fleming D M, Zambon M C. Multiplex transcription-PCR inversa para la vigilancia de los virus de influenza A y B en Inglaterra y Gales en 1995 y 1996.J. Clin Microbiol.1997;35:2076–2082. [Artículo gratuito de PMC][PubMed][Google Académico]

31Elnifro EM, Cooper RJ, Klapper PE, Bailey AS, Bone AB Diagnóstico de queratoconjuntivitis viral por clamidia: ¿qué prueba de laboratorio?Br J Ophthalmol.1999;83:622–627. [Artículo gratuito de PMC][PubMed][Google Académico]

32.Emmanuel P J. Reacción en cadena de la polimerasa desde el banco hasta la cama. Aplicaciones para enfermedades infecciosas.J Fla Med Assoc.1993;80:627–630.[PubMed][Google Académico]

33.Fan J, Henrickson K J, Savatski L L. Diagnóstico simultáneo rápido de infecciones por virus respiratorios sincitiales A y B, virus de influenza A y B, y virus de parainfluenza humana tipos 1, 2 y 3 mediante la enzima de reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa múltiplex ensayo de hibridación (Hexaplex)Clin Infect Dis.1998;26:1397–1402.[PubMed][Google Académico]

34.García L, Tercero J C, Legido B, Ramos J A, Alemán J, Sanz M. Rapid detection ofActinobacillus actinomycetemcomitans,Prevotella intermediayPorphyromona gingivalispor PCR multiplex.Res. Periodontal J.1998;33:59–64.[PubMed][Google Académico]

35.Godfroid E, Heinderyckx M, Mansy F, Fayt I, Noel J C, Thiry L, Bollen A. Detección e identificación de ADN viral del papiloma humano, tipos 16, 18 y 33 mediante una combinación de reacción en cadena de la polimerasa y captura colorimétrica en fase sólida ensayo de hibridación.Métodos J Virol.1998;75:69–81.[PubMed][Google Académico]

36.Grondahl B, Puppe W, Hoppe A, Khne I, Weigl J A L, Schmitt H J. Identificación rápida de nueve microorganismos que causan infección aguda del tracto respiratorio mediante PCR de transcripción inversa múltiplex de un solo tubo: estudio de viabilidad.J. Clin Microbiol.1999;37:1–7. [Artículo gratuito de PMC][PubMed][Google Académico]

37.Harmon KM, Ransom GM, Wesley I V. Diferenciación deCampylobacter jejuniycampilobacter colipor reacción en cadena de la polimerasa.Sondas de células Mol.1997;11:195–200.[PubMed][Google Académico]

38.Harris E. Transferencia adecuada de tecnología molecular.Monitor tecnológico de Asia Pacífico.1996;13:29–33. [Google Académico]

39.Harris E, Kropp G, Belli A, Rodriguez B, Agabian N. Ensayo de PCR multiplex de un solo paso para la caracterización del Nuevo MundoLeishmaniacomplejos.J. Clin Microbiol.1998;36:1989–1995. [Artículo gratuito de PMC][PubMed][Google Académico]

40Harrison T J. La reacción en cadena de la polimerasa: un momento de transición de la investigación a la rutina.J. Clin Pathol.1998;51:491–492. [Artículo gratuito de PMC][PubMed][Google Académico]

41.Hassan-Walker AF, Cope AV, Griffiths PD, Emery V C. Transcripción del gen señuelo del asesino natural del citomegalovirus humano, UL18,in vitroyvivir.J Gen Virol.1998;79:2113–2116.[PubMed][Google Académico]

42.Hendolin PH, Markkanen A, Ylikoski J, Wahlfors J J. Uso de PCR multiplex para la detección simultánea de cuatro especies bacterianas en derrames del oído medio.J. Clin Microbiol.1997;35:2854–2858. [Artículo gratuito de PMC][PubMed][Google Académico]

43.Henegariu O, Heerema N A, Dlouhy SR, Vance G H, Vogt PH. Multiplex PCR: parámetros críticos y protocolo paso a paso.BioTécnicas.1997;23:504–511.[PubMed][Google Académico]

44.Hengen P N. Optimización de multiplex y LA-PCR con betaína.Tendencias Biol Sci.1997;22:225–226.[PubMed][Google Académico]

45.Heredia A, Soriano V, Weiss S H, Bravo R, Vallejo A, Denny T N, Epstein J S, Hewlett I K. Desarrollo de un ensayo de PCR multiplex para la detección y discriminación simultánea de VIH-1, VIH-2, HTLV-I y HTLV-II.Clin Diagnóstico Virol.1996;7:85–92.[PubMed][Google Académico]

46.Hewlett I K, Ruta M, Cristiano K, Hawthorne C A, Epstein J S. Coamplificación de múltiples regiones del genoma del VIH-1 por la reacción en cadena de la polimerasa: uso potencial en el diagnóstico múltiple.Oncogén.1989;4:1149.[PubMed][Google Académico]

47.Hu K O, Yu C H, Lee S, Villamil F G, Vierling J M. Detección simultánea del ADN del virus de la hepatitis B y el ARN del virus de la hepatitis C mediante una técnica combinada de reacción en cadena de la polimerasa de un solo paso.hepatología.1995;21:901–907.[PubMed][Google Académico]

48.Jackson J B. Reacción en cadena de la polimerasa en medicina transfusional.Transfusión.1990;30:51.[PubMed][Google Académico]

49.Jackson R, Morris D J, Cooper R J, Bailey A S, Klapper P E, Cleator G M. Reacción en cadena de polimerasa multiplex para adenovirus y virus del herpes simple en hisopos oculares.Métodos J Virol.1996;56:41–48.[PubMed][Google Académico]

50Jacobi V, Bachand G D, Hamelin R C, Castello J D. Desarrollo de un ensayo de RT-PCR de inmunocaptura multiplex para la detección y diferenciación de los tobamovirus del mosaico del tomate y el tabaco.Métodos J Virol.1998;74:167–178.[PubMed][Google Académico]

51.Jin L, Richards A, Brown D W G. Desarrollo de una PCR de doble diana para la detección y caracterización del virus del sarampión en muestras clínicas.Sondas de células Mol.1996;10:191–200.[PubMed][Google Académico]

52.Kaucner C, Stinear T. Detección sensible y rápida de viableGiardiaquistes yCriptosporidio menorooquistes en muestras de agua de gran volumen con filtros de cartucho de fibra de vidrio enrollados y PCR de transcripción inversa.Aplicación Environ Microbiol.1998;64:1743–1749. [Artículo gratuito de PMC][PubMed][Google Académico]

53.Kebelmann-Betzing C, Seeger K, Dragon S, Schmitt G, Moricke A, Schild TA, Henze G, Beyermann B. Ventajas de un nuevoTaqADN polimerasa en PCR multiplex y PCR de liberación prolongada.BioTécnicas.1998;24:154–158.[PubMed][Google Académico]

54.Klapper PE, Jungkind D L, Fenner T, Antinozzi R, Schirm J, Blanckmeister C. Estudio de flujo de trabajo internacional multicéntrico de un instrumento de reacción en cadena de polimerasa automatizado.Clin Chem.1998;44:1737–1739.[PubMed][Google Académico]

55.Kwok S, Higuchi R. Evitar falsos positivos con PCR.Naturaleza.1989;339:237–238.[PubMed][Google Académico]

56.Lazarus P, Caruana S. Tipificación de cepas comunes del virus del papiloma humano mediante PCR multiplex.Bioquímica anal.1996;243:198–201.[PubMed][Google Académico]

57.Linz U, Delling U, Rübsamen-Waigmann H. Estudios sistemáticos sobre parámetros que influyen en el rendimiento de la reacción en cadena de la polimerasa.J Clin Chem Clin Biochem.1990;28:5–13.[PubMed][Google Académico]

58.Livache T, Bazin H, Mathis G. Conducción de polímeros en dispositivos microelectrónicos como herramientas para análisis biológicos.Clin Chim Acta.1998;278:171–176.[PubMed][Google Académico]

59.Mahony J B, Jang D, Chong S, Luinstra K E, Sellors J W, Tyndall M, Chernesky M. Detección deChlamydia trachomatis,Neisseria gonorrhoeae,Ureaplasma urealyticum, yMycoplasma genitaliumen muestras de orina de la primera evacuación por reacción en cadena de la polimerasa multiplex.Diagnóstico Mol.1997;2:161–168.[PubMed][Google Académico]

60Mahony J B, Luinstra KE, Tyndall M, Sellors J W, Krepel J, Chernesky M. Multiplex PCR para la detección deChlamydia trachomatisyNeisseria gonorrhoeaeen especímenes genitourinarios.J. Clin Microbiol.1995;33:3049–3053. [Artículo gratuito de PMC][PubMed][Google Académico]

61.Markoulatos P, Samara V, Siafakas N, Plakokefalos E, Spyrou N, Moncany M L. Desarrollo de una reacción en cadena de la polimerasa cuádruple para la detección del citomegalovirus humano.Anal de laboratorio de J Clin.1999;13:99–105. [Artículo gratuito de PMC][PubMed][Google Académico]

62.McElhinney L M, Cooper R J, Morris DJ. Reacción en cadena de la polimerasa multiplex para herpesvirus-6 humano, citomegalovirus humano y ADN de β-globina humana.Métodos J Virol.1995;53:223–233.[PubMed][Google Académico]

63.Minjolle S, Michelet C, Jusselin I, Joannes M, Cartier F, Colimon R. Amplificación de los seis principales herpesvirus humanos del líquido cefalorraquídeo mediante una sola PCR.J. Clin Microbiol.1999;37:950–953. [Artículo gratuito de PMC][PubMed][Google Académico]

64.Mitrani-Rosenbaum S, Tsvieli R, Lavie O, Boldes R, Anteby E, Shimonovitch S, Lazarovitch T, Friedmann A. Detección simultánea de tres agentes comunes de transmisión sexual mediante la reacción en cadena de la polimerasa.Soy J Obstet Gynecol.1994;171:784–790.[PubMed][Google Académico]

sesenta y cinco.Mitsuhashi M. Informe técnico: parte 2. Requisitos básicos para diseñar cebadores de PCR óptimos.Anal de laboratorio de J Clin.1996;10:285–293.[PubMed][Google Académico]

66.Morse S A, Trees D L, Htun Y, Radebe F, Orle K A, Dangor Y, Beck-Sague C M, Schmid S, Fehler G, Weiss J B, Ballard R C. Comparación de diagnóstico clínico y métodos moleculares y de laboratorio estándar para el diagnóstico de enfermedad de úlcera genital en Lesotho: asociación con la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana.J Infecciones Dis.1997;175:583–589.[PubMed][Google Académico]

67.Moschettini D, De Milito A, Catucci M, Marconi A, Rinina C, Bianchi-Bandinelli M L, Valensin P E. Detección del virus del herpes humano 6 y 7 en receptores de trasplante de corazón mediante el método de reacción en cadena de la polimerasa multiplex.Eur J Clin Microbiol Infect Dis.1998;17:117–119.[PubMed][Google Académico]

68.Mutter G L, Boynton KA. Sesgo de PCR en la amplificación de los alelos del receptor de andrógenos, un marcador de repetición de trinucleótidos utilizado en estudios de clonalidad.Ácidos Nucleicos Res.1995;23:1411–1418. [Artículo gratuito de PMC][PubMed][Google Académico]

69.Myeroson D, Lingenfelter PA, Gleaves CA, Meyers JD, Bowden R A. Diagnóstico de neumonía por citomegalovirus por reacción en cadena de la polimerasa con tejido pulmonar congelado archivado y líquido de lavado broncoalveolar.Soy J. Clin Pathol.1993;100:407–413.[PubMed][Google Académico]

70.Nadin-Davis SA, Huang W, Wandeler A I. El diseño de la reacción en cadena de la polimerasa específica de la cepa para la discriminación de la cepa del virus de la rabia del mapache de los virus de la rabia autóctonos de Ontario.Métodos J Virol.1996;57:1–14.[PubMed][Google Académico]

71.Nedjar S, Mitchell F, Biswas R. Amplificación y detección simultáneas de secuencias genómicas específicas del virus de la hepatitis B y el virus de la hepatitis C en muestras de suero.JMed Virol.1994;42:212–216.[PubMed][Google Académico]

72.Nicodème P, Steyaert J. Selección de cebadores de oligonucleótidos óptimos para PCR multiplex.Sistema Inteligente Mol Biol.1997;51:210–213.[PubMed][Google Académico]

73.Orle K A, Gates C A, Martin D H, Body B A, Weiss J B. Detección PCR simultánea deHaemophilus ducreyi,Treponema pálido, y virus del herpes simple tipos 1 y 2 de úlceras genitales.J. Clin Microbiol.1996;34:49–54. [Artículo gratuito de PMC][PubMed][Google Académico]

74.Osiowy C. Detección directa de virus respiratorio sincitial, virus parainfluenza y adenovirus en muestras respiratorias clínicas mediante un ensayo de PCR de transcripción inversa múltiplex.J. Clin Microbiol.1998;36:3149–3154. [Artículo gratuito de PMC][PubMed][Google Académico]

75.Pizzighella S, Pisoni G, Bevilacqua F, Vaona A. Detección simultánea de la reacción en cadena de la polimerasa y tipificación de restricción para el diagnóstico de la infección por el virus del papiloma genital humano.Métodos J Virol.1995;55:245–256.[PubMed][Google Académico]

76.Polz M F, Cavanaugh C M. Sesgo en las proporciones de plantilla a producto en PCR multiplantilla.Aplicación Environ Microbiol.1998;64:3724–3730. [Artículo gratuito de PMC][PubMed][Google Académico]

77.Pozo F, Tenorio A. Detección y tipificación de herpesvirus linfotrópicos por reacción en cadena de la polimerasa multiplex.Métodos J Virol.1999;79:9–19.[PubMed][Google Académico]

78.Pring-Akerblom P, Trijssenaar F E J, Adrian T, Hoyer H. Reacción en cadena de polimerasa multiplex para la detección específica de subgénero de adenovirus humano en muestras clínicas.JMed Virol.1999;58:87–92.[PubMed][Google Académico]

79.Raeymaekers L. Un comentario sobre las aplicaciones prácticas de la PCR competitiva.Genoma Res.1995;5:91–94.[PubMed][Google Académico]

80.Rajeev B, Biswas J. Técnicas biológicas moleculares en patología oftálmica.Indio J Ophthalmol.1998;46:3–13.[PubMed][Google Académico]

81.Lea S J, Kurtz J B. Diagnóstico de laboratorio de infecciones virales comunes del sistema nervioso central mediante el uso de un único ensayo de detección de PCR multiplex.J. Clin Microbiol.1999;37:1352–1355. [Artículo gratuito de PMC][PubMed][Google Académico]

82.Lea S J, Jeffery K J M, Bangham C R M. Meningitis aséptica y encefalitis: el papel de la PCR en el laboratorio de diagnóstico.J. Clin Microbiol.1997;35:691–696. [Artículo gratuito de PMC][PubMed][Google Académico]

83.Rees W A, Yager TD, Korte J, von Hippel PH. La betaína puede eliminar la dependencia de la composición del par de bases de la fusión del ADN.Bioquímica.1993;32:137–144.[PubMed][Google Académico]

84.Repp R, Rhiel S, Heermann KH, Schaefer S, Keller C, Ndumbe P, Lampert F, Gerlich W H. Genotipado por reacción en cadena de la polimerasa multiplex para la detección de la transmisión endémica del virus de la hepatitis B.J. Clin Microbiol.1993;31:1095–1102. [Artículo gratuito de PMC][PubMed][Google Académico]

85.Reubel G H, Crabb BS, Studdert M J. Diagnóstico de infecciones por gammaherpesvirus equino 2 y 5 por reacción en cadena de la polimerasa.Arco Virol.1995;140:1049–1060.[PubMed][Google Académico]

86.Rithidech K N, Dunn J J, Gordon C R. Combinación de PCR multiplex y touchdown para detectar polimorfismos de microsatélites murinos.BioTécnicas.1997;23:36–45.[PubMed][Google Académico]

87.Roberts T C, Storch G A. Multiplex PCR para el diagnóstico de linfoma y toxoplasmosis del sistema nervioso central relacionados con el SIDA.J. Clin Microbiol.1997;35:268–269. [Artículo gratuito de PMC][PubMed][Google Académico]

88.Robertson J M, Walsh-Weller J. Introducción al diseño de cebadores de PCR y optimización de reacciones de amplificación.Métodos Mol Biol.1998;98:121–154.[PubMed][Google Académico]

89.Rochelle P A, Leon R D, Stewart M H, Wolfe R L. Comparación de cebadores y optimización de las condiciones de PCR para la detección deCriptosporidio menorygiardia lambliaen agua.J. Clin Microbiol.1997;63:106–114. [Artículo gratuito de PMC][PubMed][Google Académico]

90.Rodriguez L L, Owens J H, Peters C J, Nichol S T. Reordenamiento genético entre los virus que causan el síndrome pulmonar por hantavirus.Virología.1998;242:99–106.[PubMed][Google Académico]

91.Roux K H. Optimización y resolución de problemas en PCR.Aplicación de métodos de PCR1995;4:S185–S194.[PubMed][Google Académico]

92.Ruano G, Brash DE, Kidd K K. PCR: los primeros ciclos.amplificaciones1991;7:1–4. [Google Académico]

93.Sevall J S. Detección de parvovirus B19 por dot-blot y reacción en cadena de la polimerasa.Sondas de células Mol.1990;4:237–246.[PubMed][Google Académico]

94.Sherlock J, Cirigliano V, Petrou M, Tutschek B, Adinolfi M. Evaluación de los ensayos de reacción en cadena de la polimerasa multiplex fluorescente cuantitativa de diagnóstico realizados en células individuales.Ann Hum Genet.1998;62:9–23.[PubMed][Google Académico]

95.Shuber AP, Grondin V J, Klinger K W. Un procedimiento simplificado para desarrollar PCR multiplex.Genoma Res.1995;5:488–493.[PubMed][Google Académico]

96.Shuber AP, Skoletsky J, Stern R, Handelin B L. Prueba eficiente de 12 mutaciones en el gen CFTR: un modelo general para el análisis de mutaciones complejas.Hum Mol Genet.1993;2:153–158.[PubMed][Google Académico]

97.Soler C, Allibert P, Chardonnet Y, Cros P, Mandrand B, Thivolet J. Detección de virus del papiloma humano tipos 6, 11, 16 y 18 en lesiones mucosas y cutáneas por la reacción en cadena de la polimerasa multiplex.Métodos J Virol.1991;35:143–157.[PubMed][Google Académico]

98.Stockton J, Ellis J S, Saville M, Clewley JP, Zambon M C. Multiplex PCR para tipificar y subtipificar los virus de la influenza y sincitial respiratorio.J. Clin Microbiol.1998;36:2990–2995. [Artículo gratuito de PMC][PubMed][Google Académico]

99Sunzeri F J, Lee T H, Bronlee RG, Busch MP. Detección simultánea rápida de múltiples secuencias de ADN retroviral mediante la reacción en cadena de la polimerasa y la cromatografía de ADN capilar.Sangre.1991;77:879–886.[PubMed][Google Académico]

100.Suzuki M T, Giovannoni S J. Sesgo causado por el recocido de plantillas en la amplificación de mezclas de genes 16S rRNA por PCR.Aplicación Environ Microbiol.1996;62:625–630. [Artículo gratuito de PMC][PubMed][Google Académico]

101.Taylor G R, Robinson P. La reacción en cadena de la polimerasa: de la genómica funcional a las clases prácticas de secundaria.Curr Opin Biotecnología.1998;9:35–42.[PubMed][Google Académico]

102.Tenorio A, Echevarria J E, Casas I, Echevarria J M, Tabares E. Detección y tipificación de herpesvirus humanos por reacción en cadena de la polimerasa multiplex.Métodos J Virol.1993;44:261–269.[PubMed][Google Académico]

103.Vandenvelde C, Verstraete M, Van Beers D. Reacción en cadena de la polimerasa multiplex rápida en muestras clínicas hervidas para un diagnóstico viral rápido.Métodos J Virol.1990;30:215–227.[PubMed][Google Académico]

104.Vangrysperre W, De Clercq K. Detección y tipificación rápidas y sensibles basadas en la reacción en cadena de la polimerasa del virus de la fiebre aftosa en muestras clínicas y aislamientos de cultivos celulares, combinados con una diferenciación simultánea con otros virus relacionados genómica y/o sintomáticamente.Arco Virol.1996;141:331–344.[PubMed][Google Académico]

105.Vesy C J, Greenson J K, Papp A C, Snyder P J, Qualman S J, Prior T W. Evaluación de biopsias de enfermedad celíaca para adenovirus 12 y uso de una reacción en cadena de polimerasa multiplex.Modo Pathol.1993;6:61–64.[PubMed][Google Académico]

106.Vet J A M, Majithia A R, Earras S A E, Tyagi S, Dube S, Poiesz B J, Kramer F R. Detección múltiplex de cuatro retrovirus patógenos mediante balizas moleculares.Proc Natl Acad Sci EE. UU.1999;96:6394–6399. [Artículo gratuito de PMC][PubMed][Google Académico]

107.Wagar E A. Aplicaciones directas de hibridación y amplificación para el diagnóstico de enfermedades infecciosas.Anal de laboratorio de J Clin.1996;10:312–325.[PubMed][Google Académico]

108.Wagner A, Blackstone N, Cartwright P, Dick M, Misof B, Snow P, Wagner GP, Bartels J, Murtha M, Pendleton J. Encuestas de familias de genes que utilizan la reacción en cadena de la polimerasa: selección de PCR y deriva de PCR.Syst Biol.1994;43:250–261. [Google Académico]

109.Walsh P S, Erlich H A, Higuchi R. Amplificación PCR preferencial de alelos: mecanismos y soluciones.Aplicación de métodos de PCR1992;1:241–250.[PubMed][Google Académico]

110.Waters L C, Jacobson S C, Kroutchinina N, Khandurina J, Foote R S, Ramsey J M. Dispositivo de microchip para lisis celular, amplificación de PCR multiplex y tamaño electroforético.quimica anal1998;70:158–162.[PubMed][Google Académico]

111.Wattel E, Mariotti M, Agis F, Gordien E, Prou ​​O, Courouce A M, Rouger P, Wain-Hobson S, Chen I S, Lefrere J J. Amplificación del ADN del virus linfotrópico T humano (HTLV) tipo I y II en HTLV-I /II-donantes de sangre seropositivos de las Antillas francesas.J Infecciones Dis.1992;165:369–372.[PubMed][Google Académico]

112.Williams J F. Estrategias de optimización para la reacción en cadena de la polimerasa.BioTécnicas.1989;7:762–769.[PubMed][Google Académico]

113.Wilson I G. Inhibición y facilitación de la amplificación de ácidos nucleicos.Aplicación Environ Microbiol.1997;63:3741–3751. [Artículo gratuito de PMC][PubMed][Google Académico]

114.Wilson W C, Chase C C L. Reacciones en cadena de la polimerasa multiplex y anidadas para la identificación de la infección por el virus de la lengua azul en el mosquito mordedor,Culicoides variipennis.Métodos J Virol.1993;45:39–47.[PubMed][Google Académico]

115.Winn-Deen E S. Automatización de métodos genéticos moleculares. Parte 2: Técnicas de amplificación de ADN.Ensayo de ligando J Clin.1996;19:21–26. [Google Académico]

116.Wirz B, Tratschin J D, Muller H K, Mitchell D B. Detección del cólera porcino y diferenciación de otros pestivirus por reacción en cadena de la polimerasa.J. Clin Microbiol.1993;31:1148–1154. [Artículo gratuito de PMC][PubMed][Google Académico]

117.Wolcott M J. Avances en métodos de detección basados ​​en ácidos nucleicos.Clin Microbiol Rev.1992;5:370–386. [Artículo gratuito de PMC][PubMed][Google Académico]

118.Wong K C, Ho B S W, Egglestone S I, Lewis W H P. Sistema de PCR dúplex para la detección simultánea deNeisseria gonorrhoeaeyChlamydia trachomatisen especímenes clínicos.J. Clin Pathol.1995;48:101–104. [Artículo gratuito de PMC][PubMed][Google Académico]

119.Woo P C Y, Chiu S S, Seto W, Peiris M. Rentabilidad del diagnóstico rápido de infecciones virales del tracto respiratorio en pacientes pediátricos.J. Clin Microbiol.1997;35:1579–1581. [Artículo gratuito de PMC][PubMed][Google Académico]

120.Wu D Y, Ugozzoli L, Pal B K, Qian J, Wallace R B. El efecto de la temperatura y la longitud del cebador de oligonucleótidos sobre la especificidad y la eficiencia de la amplificación por la reacción en cadena de la polimerasa.ADN Celular Biol.1991;10:233–238.[PubMed][Google Académico]

121.Yang C-F, De L, Holloway BP, Pallansch M A, Kew O M. Detección e identificación de poliovirus relacionados con la vacuna mediante la reacción en cadena de la polimerasa.Resolución de virus1991;20:159–179.[PubMed][Google Académico]

122.Yourno J. Un método para PCR anidada con tubos de reacción cerrados individuales.Aplicación de métodos de PCR1992;2:60–65.[PubMed][Google Académico]

123.Zheng P S, Li S R, Iwasaka T, Song J, Gui M H, Sugimori H. Detección simultánea mediante PCR multiplex de consenso de alto y bajo riesgo y otros tipos de virus del papiloma humano en muestras clínicas.Gynecol Oncolo.1995;58:179–183.[PubMed][Google Académico]

124.Zimmermann K, Schogl D, Plaimauer B, Mannhalter J W. PCR competitiva múltiple cuantitativa del ADN del VIH-1 en un solo tubo de reacción.BioTécnicas.1996;21:480–484.[PubMed][Google Académico]

125.Zou S. Un enfoque práctico para la detección genética de variantes del virus de la influenza.J. Clin Microbiol.1997;35:2623–2627. [Artículo gratuito de PMC][PubMed][Google Académico]

126.Zou S, Stansfield C, Bridge J. Identificación de nuevas variantes del virus de la influenza B mediante PCR de transcripción inversa múltiplex y el ensayo de movilidad heterodúplex.J. Clin Microbiol.1998;36:1544–1548. [Artículo gratuito de PMC][PubMed][Google Académico]