La clonación molecular requiere algunosmetodo de tamizaje de coloniaspor la presencia de un inserto. Tradicionalmente esto se ha hecho condigestión con enzimas de restricción;sin embargo, Colony PCR puede lograr lo mismo en menos tiempo y por menos dinero. Los pasos clave para la PCR de colonias son: 1) diseñar cebadores para detectar la presencia de su inserto; 2) configurar unreacción PCR estándarn (cebadores, dNTP, polimerasa) usando el sobrenadante de bacterias lisadas como plantilla; y 3)ejecute su producto de PCR en un gel para analizar el tamaño del producto. Esta publicación de blog analiza algunos de los aspectos clave que se deben tener en cuenta al realizar una PCR de colonias. El primer paso y quizás el más importante para la PCR de colonias es diseñarcebadores. Existen 3 estrategias para el diseño de cebadores: 1) cebadores específicos de inserción, 2) cebadores específicos de columna vertebral y 3) cebadores específicos de orientación. Cebadores específicos de insertos:Los cebadores específicos de inserción están diseñados para hibridarse con una secuencia específica de inserción. Este es un tipo de prueba de "sí o no", con un clon positivo que amplifica un producto y un clon negativo que no produce ningún producto. Además, este tipo de cebador solo le indica si su inserto específico está presente, pero no si está en la orientación correcta o incluso si está en la columna vertebral de su plásmido. Cebadores específicos de la columna vertebral:Una segunda opción es diseñar cebadores específicos de la columna vertebral. Estos cebadores están diseñados para hibridarse con los sitios que flanquean el sitio de inserción. Un clon positivo producirá un producto de mayor tamaño que un clon negativo sin el inserto. Este tipo de par de cebadores puede decirle si el inserto es del tamaño correcto y si está dentro de su columna vertebral. Este tipo de par de cebadores también es excelente para seleccionar clones creados con la misma estructura pero que contienen diferentes insertos. Cuando diseña cebadores para hibridar fuera del sitio de clonación, no importa cuál sea la secuencia del inserto, lo que le permite usar el mismo par de cebadores para detectar la presencia de muchos insertos diferentes. La desventaja: este tipo de primer no proporciona información sobre la orientación del inserto. Cebadores específicos de orientación:Si necesita información sobre la orientación de las inserciones, entonces podría considerar diseñar cebadores específicos de orientación. La clonación de extremos romos es un ejemplo de cuándo es posible que desee conocer la orientación del inserto. Un miembro de este tipo de par de cebadores se hibrida con una secuencia que flanquea el inserto y un cebador se hibrida con el inserto. Una forma sencilla de crear este tipo de par de cebadores es mezclar y combinar cebadores específicos de inserto y específicos de columna vertebral.
Diseño de cebadores de PCR de colonias
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Cada enfoque tiene ventajas y desventajas, que se resumen en la siguiente tabla. El tipo de imprimaciones que utilice depende de sus preferencias. De cualquier manera, asegúrese de probar los cebadores de PCR de su colonia antes de usarlos para detectar colonias. La mejor manera de hacer esto es usando su vector con y sin un inserto para verificar que los cebadores amplifican los productos de PCR del tamaño esperado.
| Diseño de imprimación | ventajas | Contras |
| Inserción específica |
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| Backbone-específico |
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Oorientación específica |
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configuración de PCR
instalando coloniareacciones de PCRes casi idéntico a preparar una reacción de PCR estándar: combine la plantilla, los cebadores, la polimerasa y los dNTP y luego incube con un programa de termociclado de PCR estándar. Una diferencia clave es que el ADN del plásmido debe liberarse de la bacteria para que sirva como plantilla de PCR. A continuación, se destacan algunos otros consejos de PCR para colonias.
Preparando plantilla: Escoja una sola colonia con un palillo de dientes plano estéril o punta de pipeta y agite en una pequeña cantidad de agua estéril. Elija de 3 a 10 colonias en total para probar, según la cantidad de colonias de fondo en su placa de control sin ligadura. Cuanto más antecedentes, más colonias necesitará examinar.
Guardar clones para cultivo posterior: En este punto, querrá conservar sus clones para usarlos más adelante. Hay algunas maneras de hacer esto. Si va a completar el análisis de PCR de su colonia el mismo día, puede guardar la suspensión de bacterias y agua sobrante y usarla para iniciar cultivos de sus clones positivos. Si desea almacenar sus clones a más largo plazo, simplemente raye las colonias en unplaca libra. Puede utilizar esta placa para iniciar cultivos líquidos. Por último, puede comenzar pequeños cultivos líquidos durante la noche con los clones que elija y solo mini-prep los positivos. Independientemente del método que elija, asegúrese de utilizar elantibiótico para la selección.
Lisado de bacterias y preparación de reacciones de PCR: La suspensión restante de bacterias y agua servirá como plantilla para su reacción de PCR. Solo necesita lisar las bacterias para liberar el ADN del plásmido hirviendo brevemente la muestra antes de usarla o agregando directamente un pequeño volumen de la muestra a la reacción de PCR. Las bacterias se lisarán durante el paso de calentamiento inicial de la reacción de PCR. Una polimerasa Taq estándar es suficiente.
Control S: Los controles pueden hacer o deshacer un experimento. Los mejores controles para una PCR de colonias son los mismos que se utilizan para verificar si los cebadores de PCR de colonias funcionan en primer lugar: el vector principal con y sin inserto. Estos controles son referencias rápidas que puede usar cuando ejecuta sus productos de PCR en un gel para determinar si las colonias contienen un inserto. También sirven como controles para su reacción de PCR. También es una buena idea ejecutar una reacción de PCR de control sin plantilla para detectar contaminación.
Análisis del tamaño del producto de PCR en un gel
Ahora que su PCR está completa, es hora de ejecutar los productos en un gel de agarosa para determinar su tamaño. Asegúrese de usar un estándar de peso molecular apropiado como referencia y de agregar un tinte de carga con glicerol a sus muestras antes de pipetearlas en el gel. La figura anterior resume los resultados esperados generalizados para los tres cebadores descritos anteriormente. Cuando se utilizan cebadores específicos de inserción (1), los clones positivos (+) darán una banda, mientras que un clon negativo (-) no. Los cebadores específicos de la columna vertebral (2) dan productos de mayor tamaño para los clones positivos (+) en comparación con los clones negativos. Finalmente, los cebadores específicos de orientación (3) dan el mismo resultado de banda (+) o sin banda (-) que los cebadores específicos de inserción, pero también indican si la inserción tiene la direccionalidad correcta.
Verificación de la secuencia de inserción con Sanger Sequencing
Después de identificar algunos clones positivos, el último paso esmini-preparaciónestos clones y enviar los plásmidos para la secuenciación de Sanger. La secuenciación le permite confirmar la secuencia del inserto, la orientación del inserto y las secuencias de las uniones entre el plásmido y el ADN del inserto. Colony PCR reducirá en gran medida la cantidad de clones que necesitará enviar para la secuenciación, pero no le dirá si sus productos tienen mutaciones.
Hay un montón de diferentesestrategias de clonación, pero independientemente de cuál sea su favorito, Colony PCR es una herramienta útil para tener en su kit de herramientas de biología molecular. ¡Considere probarlo la próxima vez que busque clones positivos!
Consejos y trucos desde el banquillo
No elija una colonia demasiado grande.Demasiadas bacterias pueden inhibir su reacción de PCR o hacer que aparezcan productos no específicos en su gel.
Cuidado con los falsos positivos.El hecho de que obtenga el producto de PCR del tamaño esperado no significa que no haya mutaciones en su inserto. Asegúrese de enviar múltiples clones positivos para la secuenciación para verificar la secuencia de inserción antes de continuar con su experimento.
Los amplicones más cortos tienden a ser mejores.Los amplicones más cortos hacen que los programas de PCR sean más cortos y es más probable que funcionen en una reacción de PCR que tiene restos bacterianos.
Utilice un control positivo.Un buen control positivo son las bacterias transformadas con el mismo plásmido principal. Si este control no amplifica un producto, entonces sabrá que podría haber algún problema con la configuración de PCR y/o el diseño del cebador.
Usar una cepa de control negativo. Una buena cepa de control negativo es un cultivo no transformado de la misma cepa de bacterias que usó para la clonación. Este tipo de control es especialmente importante para los cebadores específicos de insertos. Si su control negativo amplifica un producto del tamaño esperado, sabe que el genoma de su bacteria ya contiene su secuencia objetivo.
Recursos adicionales
- Descripción general de Promega para la detección de recombinantes
- Descripción general de New England Biolabs de Colony PCR
Recursos adicionales en el blog de Addgene
- aprender a hacerClonación de restricción
- IntentarClonación SLIC
- Aprender acercaAsamblea Gibson
Recursos adicionales en Addgene.org
- Leer acerca deElección de una técnica de clonación molecular
- Aprender aRealizar una transformación bacteriana
- Deposite sus clones positivos con nosotros
FAQs
¿Qué es el método PCR de colonias? ›
Colony PCR es un método para examinar rápidamente colonias de levaduras o bacterias que han crecido en medios selectivos después de un paso de transformación, para verificar que la construcción genética deseada está presente o para amplificar una parte de la construcción.
¿Qué polimerasa se utiliza para la PCR de colonias? ›GoTaq® DNA Polymerase es la opción ideal para aplicaciones de PCR en colonias. El tampón mejorado puede manejar la plantilla "sucia" mejor que un tampón de reacción convencional, y el tampón de reacción Green GoTaq le permite cargar los productos de PCR directamente en un gel después de la amplificación.
¿Cuáles son los elementos necesarios para realizar una PCR de colonia? ›Configurar reacciones de PCR de colonias es casi idéntico a preparar una reacción de PCR estándar: combine la plantilla, los cebadores, la polimerasa y los dNTP y luego incube con un programa de termociclado de PCR estándar. Una diferencia clave es que el ADN del plásmido debe liberarse de la bacteria para que sirva como plantilla de PCR.
¿Por qué mi colony pcr no funciona? ›El problema más probable es una concentración demasiado alta de células en la reacción de PCR de su colonia . Use una punta de 10 ul para tocar la colonia, luego use la punta para inocular 50 ul de agua estéril raspando la punta alrededor del costado del tubo. Utilice 0,5 ul del agua en su reacción de PCR.
¿Qué es la PCR en bacterias? ›1 La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que aplica cebadores bacterianos de amplio espectro y se combina con la secuenciación del ADN (PCR bacteriana) es un método que se puede utilizar para amplificar y analizar los genes que codifican el ARN ribosómico (ADNr 16S) de la mayoría de las especies bacterianas .
¿Cuánto tiempo tarda la colonia pcr? ›La PCR de colonias basada en coli y los controles de colonias se pueden completar en aproximadamente 1 hora . Las reacciones realizadas con esta mezcla se pueden cargar directamente en un gel para electroforesis.
¿Qué tipos de PCR hay? ›Este proceso se conoce como PCR de transcripción inversa (rtPCR). Las pruebas de PCR y de rtPCR detectan la presencia de un patógeno. Otro tipo de prueba de PCR conocida como PCR cuantitativa (qPCR) mide la cantidad de patógenos en la muestra. La qPCR se puede hacer al mismo tiempo que la PCR o la rtPCR.
¿Qué son los primers en PCR? ›Los primers son secuencias de oligonucleótidos que flanquean y delimitan la secuencia blanco que se desea amplificar y son complementarios a ésta. Generalmente su tamaño oscila entre 15-25 pares de bases y la cantidad de G-C no debe ser más del 55% de la secuencia.
¿Cuánto ADN hay que agregar en una reacción de PCR? ›Son necesarios por tanto moléculas cortas (entre 10 y 30 bases) de DNA de cadena sencilla. Estas moléculas son los cebadores o primers de la reacción.
¿Qué es la PCR y sus pasos? ›La PCR común se realiza con ciclos que tienen tres pasos de temperatura. Los pasos de ciclos a menudo están precedidos por un choque térmico (llamado "hold") a alta temperatura (> 90 °C), y seguido por otro hold al final del proceso para la extensión de producto final o el breve almacenaje.
¿Cómo elegir un primer para PCR? ›
En general, el primer debe contener alrededor de 15-18 pb de secuencia del gen blanco que es requerido para realizar la PCR. Pero además, debe agregar el sitio de restricción en el extremo 5 ' del primer más una secuencia aleatoria de 6 pb para asegurar que la enzima de restricción pueda cortar eficiente al ADN.
¿Cómo saber si la PCR es exitosa? ›La comparación de sus muestras de PCR con las muestras de control (tubos no sometidos a PCR) confirmará el éxito de la PCR . Sus muestras de PCR y muestras de control se procesarán junto con una escalera de ADN. Una escalera de ADN contiene fragmentos de ADN de tamaño conocido, medido en pares de bases (pb).
¿Qué podría salir mal en una PCR? ›Las dos fuentes de errores que ocurren durante la amplificación de ADN por PCR son (1) los errores cometidos por la polimerasa y (2) el daño térmico del ADN en forma de cadena doble y sencilla.
¿Se puede hacer colonia PCR en levadura? ›Los resultados muestran que, de hecho , la PCR directa se puede utilizar para la amplificación del ADN genómico de la levadura utilizando tanto un medio líquido como muestras de colonias .
¿Qué es la PCR y para qué sirve? ›¿Qué son las pruebas de PCR? Las pruebas de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) son una forma rápida y muy precisa de diagnosticar ciertas enfermedades infecciosas y cambios genéticos. Las pruebas detectan el ADN o el ARN de un patógeno (el organismo que causa una enfermedad) o células anormales en una muestra.
¿Cuáles son los pasos de la PCR? ›Estas tres etapas: 1) desnaturalización, 2) alineamiento y 3) ex- tensión del ADN, se repiten sucesivamente, en cada nuevo ciclo se amplifica simultáneamente la región de interés de las dos cadenas complementarias.
¿Qué es el PCR y sus aplicaciones? ›Como ya se ha explicado, la técnica PCR permite identificar la presencia de secuencias conocidas de ADN (o ARN, en el caso de algunos virus) en una muestra. Esto tiene importantes aplicaciones médicas, pues permite diagnosticar una infección vírica antes de que el paciente muestre síntomas.
¿Que se entiende por aislamiento de colonias bacterianas? ›Es la separación de un determinado microorganismo del resto de microorganismos que le acompañan. El método más usual es la siembra por estría sobre un medio de cultivo sólido adecuado dispuesto en una placa de petri.