Publicado el 25 de noviembre de 2020
Respuesta
Las bandas inesperadas o múltiples que está experimentando en los resultados de su PCR probablemente sean el resultado de una unión no específica o la formación de un dímero de cebador. Pruebe los siguientes consejos para solucionar este problema:
- Evite los ciclos excesivos, ya que esto puede aumentar la posibilidad de una amplificación no específica; para la mayoría de las aplicaciones de PCR, 25-35 ciclos son suficientes
- Evite las impurezas y los contaminantes en los componentes de su PCR, ya que pueden inhibir la PCR y provocar una amplificación incorrecta.
- Evite largos tiempos de extensión, para la mayoría de las aplicaciones de PCR, un tiempo de extensión de 1 min/kb es suficiente
- Evite los tiempos de recocido prolongados, ya que esto puede provocar un cebado falso; para la mayoría de las aplicaciones de PCR, los tiempos de recocido típicos son de 15 a 30 segundos.
- Optimice la temperatura de recocido, a bajas temperaturas, los imprimadores pueden unirse de forma no específica a la plantilla
- Compruebe el diseño de la imprimación
Recursos adicionales
FAQs
¿Por qué obtenemos múltiples bandas en PCR? ›
Las condiciones de la reacción de PCR no son adecuadas, la temperatura de hibridación es baja o el número de ciclos es grande, la unión no específica de los cebadores y las plantillas de ADN en el sistema de reacción, lo que da como resultado una gran cantidad de bandas de unión no específicas en los resultados de la reacción.
¿Por qué hay muchas bandas en la electroforesis en gel? ›La matriz de gel actúa como un tamiz: las moléculas de ADN más pequeñas migran más rápido que las más grandes , por lo que las moléculas de ADN de diferentes tamaños se separan en bandas distintas durante la electroforesis.
¿Qué representa una banda en un gel de agarosa? ›Cuando un gel se tiñe con un pigmento que se une al ADN, los fragmentos de ADN pueden verse como bandas, las cuales representan un grupo de fragmentos de ADN del mismo tamaño.
¿Qué representan las bandas en PCR? ›Una banda tenue y delgada indica que una cantidad relativamente pequeña de esa molécula de ADN está presente en la muestra . Los carriles con 1 banda pueden indicar que la muestra contiene solo una molécula de ADN, mientras que los carriles con múltiples bandas indican la presencia de múltiples moléculas.
¿Cómo saber si la PCR es exitosa? ›La comparación de sus muestras de PCR con las muestras de control (tubos no sometidos a PCR) confirmará el éxito de la PCR . Sus muestras de PCR y muestras de control se procesarán junto con una escalera de ADN. Una escalera de ADN contiene fragmentos de ADN de tamaño conocido, medido en pares de bases (pb).
¿Cómo se eliminan bandas no específicas en PCR? ›Puede usar DMSO (0.5ul/25 ul rxn) para reducir/eliminar la banda inespecífica. Pero cuando lo esté usando, debe aumentar la cantidad de enzima en un 50%. También puedes intentar usar BSA. A partir de 10mg/ml de caldo, puedes poner 1-2 ul a 25ul rxn.
¿Qué significa dos bandas en la electroforesis? ›Esto se debe a que después de que la enzima haya cortado el ADN, habrá dos fragmentos de ADN de diferentes tamaños . Si el paciente tiene una mutación en ambos genes, se producirán dos bandas porque se cortarán todos los fragmentos.
¿Que puede salir mal en una electroforesis? ›Carga de muestras incorrectas
El exceso de la muestra podría causar que sean manchas grandes o que aparezcan más pequeñas de lo que realmente son; a su vez, muy poco de la muestra puede ser imposible de ver.
Debido a que cada molécula de ADN tiene carga negativa, un campo eléctrico puede arrastrarla a través del gel. Las moléculas de ADN pequeñas se mueven más rápidamente a través del gel que las moléculas de ADN más grandes . El resultado es una serie de 'bandas', cada una de las cuales contiene moléculas de ADN de un tamaño particular.
¿Qué representa cada banda diferente en un perfil de ADN? ›Las líneas (o bandas) representan piezas de ADN de diferentes tamaños . Si dos muestras provienen del mismo individuo, todas las bandas de una muestra deben coincidir con todas las bandas de la otra.
¿Cómo analizar los resultados del gel PCR? ›
Los productos de PCR se analizan más comúnmente mediante electroforesis en gel de agarosa . Los resultados se pueden visualizar con bromuro de etidio o colorantes no tóxicos como SYBR ® green. La intensidad de la banda se puede utilizar para estimar la cantidad de producto de un peso molecular determinado en relación con una escalera.
¿Por qué hay dos bandas para cada marcador de ADN? ›Uso de perfiles de ADN para identificar individuos
Si los dos alelos son iguales, el individuo es homocigoto para ese marcador en particular y solo aparecerá una banda en el gel. Si aparecen dos bandas diferentes en el gel, entonces el individuo ha heredado dos alelos diferentes para ese marcador y es heterocigoto .
Tiempos de ciclo más bajos : esto es especialmente útil cuando la concentración de su plantilla es más alta. Mantener dentro de 20-35 ciclos. 3. Reducir los tiempos de extensión/aumentar la temperatura de hibridación: ambos ayudarán a mejorar los resultados de la PCR al reducir la aparición de bandas de unión y manchado no específicas.
¿Qué causa los dímeros de cebadores en la PCR? ›Causas de PCR/dímeros de cebadores en reacciones de secuenciación
Contaminación de la plantilla, el stock de cebadores u otros reactivos de secuenciación con dímeros de cebadores . Una temperatura de recocido demasiado baja durante la PCR. Dos sitios de unión de cebadores presentes en la plantilla.
Un ADN de pureza aceptable debe tener al menos una relación A260/280 > 1.6. Un valor A260/280 < 1.6 indica una posible contaminación por compuestos aromáticos como fenoles y proteínas. Un radio A260/280 > 2.1 podría deberse a la presencia de ARN en la muestra.